Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais
Summary
Para entender a estrutura das redes neuronais, caracterização funcional e morfológica de neurônios individuais é uma necessidade. Aqui, nós demonstramos rotulagem juxtasomal biocitina, que permite que registros eletrofisiológicos na configuração extracelular, mas mantendo a capacidade de rotular intracelular do neurônio para a reconstrução post hoc de dendrítica e arquitetura axonal.
Abstract
O córtex cerebral é caracterizada por múltiplas camadas e muitos tipos de células distintas que em conjunto, como uma rede de responsáveis por várias funções cognitivas superiores, incluindo a tomada de decisões, o comportamento sensório-guiada ou memória. Para entender como essas redes neuronais complexas executar tais tarefas, um passo crucial é determinar a função (ou atividade elétrica) de tipos de células individuais dentro da rede, preferencialmente quando o animal está realizando uma tarefa cognitiva relevante. Além disso, é igualmente importante para determinar a estrutura anatômica da rede e da arquitetura morfológica dos neurônios individuais para permitir a engenharia reversa da rede cortical. Avanços técnicos disponíveis hoje permitem gravar a atividade celular em acordada, comportando animais com a valiosa opção de post hoc identificar os neurônios registrados. Aqui, nós demonstrar a técnica de rotulagem juxtasomal biocitina, que envolve a ação de gravação potenciômetroal spiking na configuração extracelular (ou solta-patch) usando pipetas de patch convencionais. A configuração de gravação juxtasomal é relativamente estável e aplicável em condições comportamentais, incluindo anestesiado, sedado, acordado fixo-cabeça, e até mesmo no animal se movendo livremente. Assim, este método permite que liga tipo de célula ação específica potencial spiking durante comportamento animal para a reconstrução dos neurônios individuais e, em última análise, todo o microcircuito cortical. Neste vídeo manuscrito, vamos mostrar como os neurônios individuais na configuração juxtasomal pode ser rotulado com biocitina em ratos anestesiados com uretano para identificação post hoc e reconstrução morfológica.
Introduction
As redes neurais consistem em vários tipos de células, caracterizado por as propriedades morfológicas e fisiológicas altamente específicos 1-7. Como consequência, os tipos de células individuais de realizar tarefas especializadas no seio da rede (ver, por exemplo Gentet et al. 8 e Burgalossi et al. 9). Estamos apenas começando a entender as funções específicas do tipo de célula através de redes neuronais e muito ainda está para ser descoberto. Para este fim, muitos laboratórios são adoptar abordagens experimentais que permitem a análise de propriedades morfológicas da mesma população neuronal do que os parâmetros fisiológicos foram obtidos 1,10-15. Aqui, demonstramos o juxtasomal técnica de marcação, que envolve 16,17 registos electrofisiolicos utilizando pipetas de patch convencionais na configuração extracelular (assim não invasiva) em combinação com a electroporação do neurónio gravado com biocitina. Ogrande vantagem desta abordagem é que a natureza não invasiva assegura que a acção potencial cravação de neurónios individuais é gravado sem alterar (por exemplo, diálise) o conteúdo intracelular da célula. Seguido por eletroporação, a abordagem juxtasomal oferece a opção de identificação post hoc celular e reconstrução de ligação de função (fisiologia) para estrutura (morfologia). Normalmente, a reconstrução morfológica envolve a reconstrução da morfologia dendrítica e axonal, que pode ser estendido para quantificação da coluna e / ou Bouton densidades ou mesmo reconstrução da morfologia neuronal com resolução nanométrica usando microscopia eletrônica. A técnica de gravação juxtasomal pode ser usado para in vivo gravações de vários tipos de células em todo camadas corticais ou em áreas sub-corticais em uma variedade de espécies, embora a maioria dos estudos têm aplicado a técnica em pequenos roedores, como camundongos ou ratos. Nossa pesquisa está focada na gravação e rotulagem de neurôniosde rato córtex somatossensorial primário (S1) e envolve a identificação visual de neurônios registrados 18, reconstruções dendríticas, em combinação com o registro preciso de um quadro de referência padronizada para fazer engenharia reversa de redes corticais 4,19 e reconstrução detalhada da arquitetura axonal caracterizar tipo específico de células locais e projeção de longo alcance como alvo 20.
Comparado com in vivo as técnicas de gravação alternativos (intracelulares ou de células inteiras), as gravações juxtasomal são relativamente estáveis e, portanto, pode ser aplicado em estados comportamentais incluindo anestesiados 21,22, sedado 14, 23 animais fixo-cabeça, ou mesmo livremente em movimento acordado 9 . Aqui, vamos mostrar rotulagem juxtasomal em S1 de um rato anestesiado-uretano, embora ressaltamos a aplicabilidade geral desta técnica para muitas preparações de escolha.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método permite a gravação de juxtasomal em ação vivo potencial spiking de unidades individuais de todo condições comportamentais (anestesiados, acordado ou se movendo livremente fixo-cabeça) com a opção do neurônio gravado para hoc classificação pós tipo de célula e / ou reconstrução 3D-rotulando biocitina. A principal vantagem é a obtenção de parâmetros fisiológicos na configuração extracelular (assim não invasiva), sendo ainda capaz de marcar o neurónio i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos Profs. Huibert Mansvelder e Bert Sakmann para amplo suporte, Dr. Marcel Oberlaender para discussões frutíferas e proporcionando rastreamento neuronal, e Brendan Lodder para assistência técnica. Os dados foram adquiridos utilizando o ntrode VI para LabVIEW, generosamente fornecidos pela R. de Bruno (Columbia Univ., NY, EUA). Esta pesquisa foi apoiada pela Max Planck Society e do Centro Bernstein de Neurociência Computacional, Tuebingen (financiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centro de Pesquisa e Neurogenomics Cognitiva (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), o financiamento para CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 e ENC-rede # P3-c3) ea VU University Amsterdam.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
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