Hornhindens Micropocket assay: En model af angiogenese i mus Eye
Summary
Protokollen beskriver corneal micropocket assay udviklet i mus.
Abstract
Musen hornhinde micropocket analysen er en robust og kvantitativ in vivo-assay til evaluering af angiogenese. Ved hjælp af standardiserede langsom frigivelse pellets indeholdende specifikke vækstfaktorer, der udløser blodkarvækst hele naturligt avaskulære hornhinde, kan måles og kvantificeres angiogenese. I dette assay den angiogene respons genereres i løbet af flere dage, afhængigt af den type og dosis af vækstfaktor anvendes. Induktionen af neovaskularisering er almindeligt udløst af enten basisk fibroblast-vækstfaktor (bFGF) eller vaskulær endotelial vækstfaktor (VEGF). Ved at kombinere disse vækstfaktorer med sucralfat og Hydron (poly-HEMA (poly (2-hydroxyethylmethacrylat))) og støbning af blandingen til pellets, kan de implanteres kirurgisk i musen øjet. Disse ensartede piller langsomt frigive vækstfaktorerne over fem eller seks dage (bFGF eller VEGF henholdsvis), der muliggør tilstrækkelig angiogen respons kræves for fartøjets område quantification hjælp af en spaltelampe. Denne analyse kan bruges til forskellige applikationer, herunder evaluering af angiogene modulator lægemidler eller behandlinger samt sammenligning mellem forskellige genetiske baggrunde påvirker angiogenese. En dygtig investigator efter udførelse af denne analyse kan implantere en pellet på mindre end 5 minutter pr øje.
Introduction
Processen med angiogenese, dannelsen af nye blodkar dannes allerede eksisterende dem, er meget kompleks og reguleres af flere endogene faktorer, der styrer forskellige trin i fartøjets spiring og morfogenese. Angiogenese er udløst på grund af en ændring i balancen mellem pro- og antiangiogene faktorer, en balance, der normalt fastholder vaskulaturen i en hvilende tilstand. Angiogenese i voksne forekommer i visse fysiologiske betingelser, såsom under den kvindelige ovariecyklus eller reparation processer såsom sårheling og vævsregenerering. Men det er også et kendetegn for flere patologier, herunder maligniteter, autoimmune sygdomme og inflammatoriske sygdomme. Inddragelsen af angiogenese i disse fysiologiske og patologiske tilstande gør det et vigtigt emne for forskning og et attraktivt mål for terapi.
På grund af kompleksiteten af angiogenese og inddragelse af flere ceLLS og faktorer i processen, herunder endotelceller, pericytter cirkulerende celler og stromale celler, in vitro-modeller fortsat er begrænsede og kan ikke rekapitulere unikke in vivo mikromiljø. Den vigtigste in vitro assays for angiogenese er i høj grad fokuseret på at observere direkte virkninger på endotelceller og måle visse skridt i angiogene proces under kontrollerede forhold. Disse assays omfatter kvantificering af endotelcelleproliferation 1 migration 2, dannelse 3 netværk, rør dannelse 4 og spiring fra sfæroider 5. Ex vivo-modeller, i modsætning til in vitro dem, er mere komplekse og indarbejde flere væv celletyper, idet et eksempel er aorta ring assay 6. Men ligesom andre systemer, kan det ikke fange bidrag cirkulerende celler og naturlige stroma endotelceller som findes in vivo. Forsøgat studere angiogenese under flow til at efterligne in vivo-indstillingen udføres ved hjælp af mikrofluide systemer 7, men selv disse analyser, selv om meget bedre, stadig ikke kan redegøre for alle rummene eksisterende in vivo.
På grund af begrænsningerne af in vitro og ex vivo angiogenese modeller in vivo modeller forbliver mere pålidelige valg for angiogenese studier. Eksempler på disse modeller omfatter implantation af gennemsigtige kamre, "vinduer", der tillader visualisering af voksende blodkar under mikroskop 8, injicerbare subkutane implantater såsom matrigel og fartøj dannelse i normale væv, såsom mus øre og hønen chorioallantoiske membran (CAM ). Men en af de mest acceptable og kvantitative in vivo angiogenese modeller er corneal micropocket neovaskularisering assayet beskrevet her, som udnytter naturligt avaskulærehornhinde som en "skærm" til at visualisere og vurdere ny angiogen 9 vækst.
Her beskriver vi corneal micropocket assay udviklet i mus. Oprindeligt blev modellen anvendt til at måle uspecifikke angiogene stimuli i kanin hornhinder. Dette blev gjort ved at indføre tumorstykker i kammervandet i det forreste kammer i kaninøjne og måles tumorinduceret neovaskularisering 11.
Imidlertid blev analysen senere udviklet sig til at studere virkningerne af specifikke vækstfaktorer for 10 til bedre at specificere og standardisere den angiogene virkning. For at frigive vækstfaktoren i øjet, blev langsom frigivelse pellets indeholdende kendte mængder af angiogene vækstfaktorer anvendes i stedet for væv. Tilgængeligheden af oprensede rekombinante angiogene proteiner såsom bFGF eller VEGF aktiveret deres anvendelse som specifikke mål for angiogenese modulaters 12. Oprindeligt var assayeti vid udstrækning anvendes i kaniner, som er lettere at arbejde med på grund af deres størrelse, men senere modellen blev oversat i mus; en mindre og billigere dyremodel. Skift fra kanin til mus gav en vigtig fordel ved at være i stand til at bruge genetisk manipulerede dyr og dermed skabe et nyt forskningsområde i de genetiske komponenter påvirker angiogenese 13. Ud over de mere acceptabel anvendelse af analyse af hornhinden i at studere angiogenese, kan andre biologiske processer også undersøgt ved hjælp af modificerede assays. For eksempel blev undersøgelser af lymphangiogenesis muliggjort gennem implantation af lav dosis bFGF pellets, der er tilladt visualisering af lymfekar gennem specifikke molekylære markører 14. Desuden har dette assay tilvejebragt et middel til at vurdere virkningerne af stråling på angiogenese 15.
I summering, corneal micropocket angiogenese assayet er et kvantitativt, reproducible, fleksibel vurdering af angiogenese in vivo. En stor fordel ved dette assay er, at måling af baggrundsniveauet fartøjer er unødvendig, fordi beholderne vokse på et naturligt avaskulært væv. Vi beskriver her protokollen af denne analyse i detaljer og diskutere forskellige scenarier, der kan opstå. Assayet består af 3 diskrete segmenter. Her vil vi beskrive fremstillingen af vækstfaktor inklusive pellets den efterfølgende kirurgisk implantation og endelig den anvendte metode til at kvantificere den resulterende neovaskulær vækst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere kritiske trin i at udføre et vellykket hornhinde analyse. Den første gør ensartede pellets stand til at blive implanteret og stimulerende fartøjer. De vigtigste dele af pellet præparat 1) med bærerfri vækstfaktor; 2) at sikre en god blanding af vækstfaktor med sucralfat og Hydron og 3) at bevæge den endelige blanding hurtigt, men omhyggeligt fra eppendorfrør til masken, hvor pillerne er støbt. Det anbefales, at "dummy" pellets ske uden vækstfaktor at praktisere teknikken. Pellets skal …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Kristin Johnson til den grafiske arbejde.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
Riferimenti
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D’Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D’Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D’Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D’Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
