Hornhinnans Micropocket Analys: En modell av angiogenes i mus Eye
Summary
Protokollet beskriver hornhinnans micropocket analys såsom utvecklats i möss.
Abstract
Musen hornhinnan micropocket analysen är en robust och kvantitativ analys in vivo för utvärdering angiogenes. Genom att använda standardiserade långsam frisättning pellets innehållande specifika tillväxtfaktorer som utlöser blodkärlstillväxt i hela naturligt avaskulära hornhinnan, kan angiogenes mätas och kvantifieras. I denna analys det angiogena svaret alstras under loppet av flera dagar, beroende på typen och dosen av tillväxtfaktorn användas. Induktionen av neovaskularisation utlöses vanligtvis genom antingen basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) eller vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Genom att kombinera dessa tillväxtfaktorer med sukralfat och hydron (poly-HEMA (poly (2-hydroxietylmetakrylat))) och gjutning av blandningen till pellets kan de inopererade i musen ögat. Dessa enhetliga pellets långsamt frigöra tillväxtfaktorer under fem eller sex dagar (bFGF eller VEGF respektive) som möjliggör tillräcklig angiogen respons som krävs för fartygets område quantification användning av en spaltlampa. Denna analys kan användas för olika tillämpningar, inklusive en utvärdering av angiogena modulator läkemedel eller behandlingar samt jämförelse mellan olika genetisk bakgrund påverkar angiogenes. En skicklig utredare efter praktisera denna analys kan implantera en pellet på mindre än 5 minuter per öga.
Introduction
Processen för angiogenes, nybildning av blodkärl bildas redan existerande sådana, är mycket komplex och regleras av flera endogena faktorer som styr olika stegen i fartygets groning och morfogenes. Angiogenes utlöses på grund av en förskjutning i jämvikten mellan pro-och anti-angiogena faktorer, en balans som normalt bibehåller vaskulaturen i ett vilotillstånd. Angiogenes hos vuxna förekommer i vissa fysiologiska förhållanden såsom under den kvinnliga äggstock cykeln eller i reparationsprocesser såsom sårläkning och vävnadsregenerering. Men det är också ett kännetecken för flera sjukdomar, inklusive maligniteter, autoimmuna sjukdomar och inflammatoriska sjukdomar. Medverkan av angiogenes i dessa fysiologiska och patologiska tillstånd är det ett viktigt ämne för forskning och ett attraktivt mål för behandling.
På grund av komplexiteten av angiogenes och medverkan av flera cells och faktorer i processen, bland annat endotelceller, pericyter, cirkulerande celler och stromaceller, in vitro-modellerna fortfarande är begränsade och inte kan rekapitulera den unika in vivo mikromiljö. Huvud in vitro-analyser av angiogenes är till stor del inriktad på att observera direkta effekter på endotelceller och mäta vissa steg i angiogen process under kontrollerade förhållanden. Dessa analyser innefattar kvantifiering av endotelcellproliferation 1, migration 2, nätverksbildning 3, rörbildning 4 och groning från sfäroider 5. Ex vivo-modeller, till skillnad från de som in vitro, är mer komplicerade och inkorporera multipla typer vävnad cell, varvid ett exempel är aortaringanalys 6. Icke desto mindre, i likhet med andra system, kan det inte fånga bidraget av cirkulerande celler och den naturliga stroma av endotelceller som existerar in vivo. Försökatt studera angiogenes i flödet för att efterlikna den miljö i vivo utförs med mikroflödessystem 7, men till och med dessa analyser, även om mycket förbättrats, fortfarande inte kan redogöra för alla fack befintliga in vivo.
På grund av begränsningar i in vitro och ex vivo angiogenesmodeller in vivo-modeller förblir de mer tillförlitliga val för angiogenesstudier. Exempel på dessa modeller inkluderar implantation av transparenta kammare, "fönster", som tillåter visualisering av växande blodkärl under mikroskop 8, injicerbara subkutana implantat såsom matrigel och kärlbildning i normala vävnader såsom mus öron och kyckling korioallantoinmembranet (CAM ). Men en av de mest acceptabla och kvantitativa in vivo angiogenes modellerna är hornhinnans micropocket kärlnybildning analys som beskrivs här, som utnyttjar naturligt avaskulärahornhinnan som en "skärm" för att visualisera och utvärdera nya angiogenes tillväxt 9.
Här beskriver vi hornhinnans micropocket analys såsom utvecklats i möss. Initialt modellen användes för att mäta ospecifika angiogena stimuli i kaninhornhinnor. Detta gjordes genom att tumör bitar i kammarvattnet i främre kammaren i kaninögon och uppmätt tumörinducerad kärlnybildning 11.
Dock analysen senare utvecklats för att studera effekter av specifika tillväxtfaktorer 10 att bättre specificera och standardisera den angiogena effekten. För att frigöra den tillväxtfaktor i ögat, har långsam frisättning pellets innehållande kända kvantiteter av angiogena tillväxtfaktorer användes istället för vävnader. Tillgången på renade rekombinanta angiogena proteiner såsom bFGF eller VEGF aktiverat deras användning som specifika mål för angiogenes modulaters 12. Initialt var analysentill stor del används i kaniner, som är lättare att arbeta med på grund av sin storlek men senare modellen översattes till möss; en mindre och billigare djurmodell. Övergången från kanin till möss gav en viktig fördel av att kunna använda genmanipulerade djur och därigenom skapa ett nytt område för forskning om genetiska komponenter som påverkar angiogenes 13. Förutom den mer acceptabel användning av kornea-analysen i att studera angiogenes, kan andra biologiska processer, undersöks också med användning av modifierade analyser. Till exempel har studier av lymfangiogenes möjliggjorts genom implantation av låg dos bFGF pellets som gjorde visualiseringen av lymfkärlen genom specifika molekylära markörer 14. Dessutom har denna analys tillhandahålls ett medel för att utvärdera effekterna av strålning på angiogenes 15.
I summering, är hornhinnans micropocket angiogenes analysen en kvantitativ, reproducible, flexibel bedömning av angiogenes in vivo. En stor fördel med denna analys är att mätningen av bakgrundsfartyg är onödigt eftersom fartygen växer på ett naturligt avaskulär vävnad. Vi beskriver här protokollet för denna analys i detalj och diskutera olika scenarier som kan uppstå. Analysen består av tre diskreta segment. Här kommer vi att beskriva framställningen av tillväxtfaktorfattande pellets, den efterföljande kirurgisk implantation och slutligen den metod som används för att kvantifiera den resulte neovaskulär tillväxt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera viktiga steg i att utföra en framgångsrik hornhinnan analys. Det första är att göra enhetliga pellets kan vara implantat och stimulerande fartyg. De viktigaste delarna av pellets förbehandlingen 1) med hjälp av bärare fritt tillväxtfaktor; 2) säkerställa en god blandning av tillväxtfaktor med sukralfat och hydron och 3) att flytta den slutliga blandningen snabbt men försiktigt från Eppendorf-rör till det nät där pelletsen gjuts. Det rekommenderas att "dummy" pelletar göras uta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Kristin Johnson för den grafiska arbetet.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
Riferimenti
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D’Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D’Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D’Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D’Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
