التداخل الحيوي طبقة لقياس حركية البروتين البروتين التفاعلات والآثار تفارغي يجند
Summary
البروتوكولات هنا وصف المقايسات الحركية للتفاعلات البروتين البروتين مع بيو طبقة التداخل. F-نوع ATP سينسيز، التي تشارك في استقلاب الطاقة الخلوية، يمكن تحول دون الوحيدات ε في البكتيريا. تكيفنا الحيوي طبقة التداخل لدراسة التفاعلات المعقدة للالحفاز مع المثبطة-C محطة مجال ε ل.
Abstract
وصفنا استخدام بيو طبقة التداخل لدراسة التفاعلات المثبطة للالوحيدات ε مع مجمع الحفاز كولاي ATP سينسيز. البكتيرية نوع F-ATP سينسيز هو الهدف من المضادات الحيوية الجديدة، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لمكافحة السل المقاوم للأدوية. فهم البكتيريا محددة لصناعة السيارات في تثبيط سينسيز ATP من قبل المجال-C محطة من الوحيدات ε يمكن أن توفر وسيلة جديدة لاستهداف إنزيم لاكتشاف أدوية مضادة للجراثيم. المجال-C محطة من ε تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين دراماتيكية عندما التحولات انزيم بين الدول النشطة وغير النشطة، وبروابط الموقع الحفاز يمكن أن تؤثر على أي من التشكل ε هو السائد. التدابير مقايسة حركية ε في ملزمة / التفكك مع مجمع الحفاز، وبشكل غير مباشر الشرق الأوسط وأفريقياسورس التحول من ربط إنزيم ε من وإلى التشكل المثبطة يبدو nondissociable. إشارة التداخل الحيوي طبقة ليست حساسة بشكل مفرط لتكوين الحل، لذلك يمكن أن تستخدم أيضا لرصد الآثار تفارغي من موقع بروابط الحفاز على التغييرات متعلق بتكوين ε ل.
Introduction
البروتين البروتين التفاعلات مهمة لكثير من العمليات البيولوجية، واستخدمت وسائل بصرية خالية من التسمية مثل السطحية بلازمون الرنين (SPR) في المختبر لدراسة حركية ملزمة والتفكك 1. معظم طرق خالية من التسمية لشل حركة جزيء حيوي واحد على سطح أجهزة الاستشعار واستخدام الإشارات الضوئية للكشف عن شريك ملزم من الحل لأنه يربط مع جزيء حيوي يجمد 1. بينما SPR هو طريقة حساسة للغاية، هو عرضة للتدخل بسبب التغيرات في معامل الانكسار من الحل تتدفق على الاستشعار 2. وإن لم يكن حساسة مثل SPR، بيو طبقة التداخل (BLI) وأقل تأثرا بالتغيرات في تكوين العينة 1،3. يستخدم BLI أجهزة الاستشعار الألياف البصرية التي لها طلاء حيويا الملكية في الطرف. النظام المستخدم هنا (محاذية-RED96) يحتوي على ثمانية طيفي. يضخ الضوء الأبيض إلى صف تحقيقات التي تتحرك على الذراع الروبوتية. أجهزة استشعار الألياف البصرية عاختار البريد من قبل تحقيقات وانتقل الى لوحة 96 جيدا تحتوي على عينات. ويجمد واحدة من الجزيئات المستهدفة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي. ثم يتم نقل أجهزة الاستشعار لآبار تحتوي على الشريك ملزم في الحل. BLI تراقب جمعية الشريك ملزم مع جزيء يجمد، ثم تراقب التفكك بعد تحريك أجهزة الاستشعار لحل دون شريك ملزمة. ملزمة للجزيئات على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي يؤدي إلى تغييرات في التدخل البصرية بين موجات الضوء التي تعكس مرة أخرى إلى طيفي من السطح الداخلي والخارجي من واجهة بين أجهزة الاستشعار والحل. هذه التغييرات في التدخل يمكن قياسها كميا، وتستخدم لتحديد معدلات الحركية للملزم والتفكك، على النحو الموجز في الرسوم المتحركة من الشكل 1.
لقد طبقنا BLI لقياس التفاعلات المعقدة بين الحفاز سينسيز ATP البكتيرية والوحيدات ε، والتي يمكن لصناعة السيارات في تثبيط الانزيم. ATP سيnthase هو nanomotor جزءا لا يتجزأ من الغشاء الدوارة التي يحفز التوليف والتحلل من ATP 4. مجمع الحفاز (F 1) يمكن أن تكون معزولة في شكل قابل للذوبان الذي يعمل بمثابة أتباز. الوحيدات ε اثنين من المجالات: المجال N-محطة (الأمراض الاستوائية المهملة) ضروري لتجميع المناسبة واقتران وظيفية للانزيم ولكن لا تتفاعل مباشرة مع مفارز الحفاز؛ المجال C-محطة (CTD) يمكن أن تمنع الانزيم من خلال التفاعل مع مفارز الحفاز متعددة 5،6. هذا التنظيم هو بوساطة ε محددة لsynthases ATP البكتيرية وليس لوحظ في نديد الميتوكوندريا. وقد برزت ATP سينسيز كهدف للأدوية المضادة للبكتيريا، كما هو مبين من قبل ادارة الاغذية والعقاقير الموافقة الأخيرة من bedaquiline لعلاج السل المقاوم للأدوية 7. وبالتالي، واستهداف دور ε في المثبطة لاكتشاف المخدرات يمكن أن يسفر عن مضادات الجراثيم التي لا تمنع ATP سينسيز الميتوكوندريا. مع مجمع الحفاز معزولة (F 1)، εيصبح سهل التفريق الوحيدات. ومع ذلك، مع ε بد أن F 1، يمكن للεCTD الخضوع لتغيير متعلق بتكوين دراماتيكية، وإدراج جزئيا في تجويف المركزي الإنزيم وتكوين دولة المثبطة التي من غير المرجح أن تنأى مباشرة 6،8. نستخدم BLI لقياس حركية F 1 / ε ملزمة والتفكك، وبشكل غير مباشر، لدراسة الآثار تفارغي من موقع الحفاز لبروابط على التشكل وε.
في نظامنا، ε تم اختياره لتجميد على سطح مستشعر منذ إشارة BLI (مثل SPR) حساس للكتلة جزيئات ملزمة على السطح. الوحيدات ε صغير (15 كيلو دالتون ~) نسبة إلى الرئيسية F 1 مجمع (347 كيلو دالتون ~). وبالتالي، فإن أكبر إشارة BLI تنجم عن ربط F 1 إلى ε يجمد. من أجل رصد F 1 التفكك، والتي يمكن أن تكون بطيئة جدا، ε يجب أن يجمد بشدة. هكذا اخترنا أن biotinylate؛ وشل على أجهزة الاستشعار streptavidin المغلفة. البروتينات يمكن المعقدة البيروكسيديز بنسبة (ط) التعديل عشوائية من سطح lysines 9، (ب) رد فعل السيستين الأصلي أو هندسيا فريدا مع البيوتين maleimide كاشف 10 أو (ج) مضيفا راثيا الببتيد البيوتين متقبل معين يتم المعقدة البيروكسيديز خلال إنزيمي في التعبير المجراة من البروتين الموسومة 11. في نظامنا، والمعقدة البيروكسيديز ε باستخدام طريقة (ج) 8. بمجرد يجمد الموسومة البيوتين ε على أجهزة استشعار streptavidin، يمكن BLI قياس ملزمة وتفكك F 1 التي تم المنضب من الوحيدات ε (F 1 (ε)). للتجارب الموصوفة هنا، قد تم القيام به المقايسات الأولية لتحديد كميات معقولة من البروتين البيروكسيديز لشل على أجهزة الاستشعار. هذا يمكن أن تختلف، اعتمادا على الوزن الجزيئي للبروتين وشريك ملزمة لها، ولكن الهدف هو تحديد كمية ضئيلة من البروتين يجمد ريوفر قبعة (ط) مقبولا الإشارة إلى الضوضاء لحركية ملزمة مع تركيز منخفض من الشريك ملزم (K تحت D) و (ب) الحد الأدنى من التشويه من حركية ملزم مع تركيز تشبع بالقرب من الشريك ملزمة. أيضا، قد تختلف العناصر المتفاعلة من biotinylation (ولكن تجنب> 1 مول البيوتين / البروتين مول)، لذلك قد تكون هناك حاجة إلى بعض الفحص الأولي لكل دفعة جديدة من البروتين البيروكسيديز للتأكد من أن إشارة BLI متسقة يمكن أن يتحقق خلال تجميد على streptavidin المغلفة أجهزة الاستشعار.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأدوات المتاحة حاليا لBLI تسمح إنتاجية كبيرة والمرونة في المقايسات للتفاعلات الجزيئية البيولوجية. يتم الاستغناء عينات حل مختلف في الآبار لوحة microtiter الأسود، ومجموعة من أجهزة الاستشعار BLI موازية مبرمجة لتتحرك ذهابا وإيابا بين أعمدة من الآبار على طبق من ذهب. وأثار الع?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر FortéBio لتقديم الرسومات المستخدمة في الشكل 1. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM083088 إلى TMD
Materials
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
Riferimenti
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes. Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).
- Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. The Enzymes. Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).
- Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).
- Cingolani, G., Duncan, T. M. Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation. Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).
- Mirsaeidi, M. After 40 years, new medicine for combating TB. Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).
- Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands. J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).
- Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface. J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).
- Loo, T. W., Clarke, D. M. Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).
- Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli. Gene. 169, 59-64 (1996).
- Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) – How Does it Work?. FortéBio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).
- Wartchow, C., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).
