Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects
Summary
De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.
Abstract
We beschrijven het gebruik van Bio-layer Interferometrie remmende subeenheid interacties van ε studie met het katalytische complex van Escherichia coli ATP synthase. Bacteriële type F ATP synthase is het doelwit van een nieuwe, door de FDA goedgekeurde antibioticum-resistente tuberculose te bestrijden. Inzicht bacterie-specifieke auto-remming van ATP synthase door het C-terminale domein van subeenheid ε kan een nieuw middel om het enzym ontdekking van antibacteriële geneesmiddelen doelwit. De C-terminale domein van ε ondergaat een dramatische conformatieverandering wanneer het enzym overgangen tussen de actieve en inactieve toestanden en katalytische plaatse liganden beïnvloeden welke conformaties ε is overheersend. De test meet kinetiek van de binding ε / dissociatie met de katalytische complex en indirect mealen de verschuiving van enzym gebonden ε en naar de schijnbaar nondissociable remmende conformatie. De Bio-laag Interferometrie signaal niet overgevoelig voor oplossing samenstelling, dus het kan ook gebruikt worden om allosterische effecten van katalytische-ter liganden op ε de conformatieveranderingen volgen.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor vele biologische processen en labelvrije optische methoden zoals Surface Plasmon Resonance (SPR) gebruikt in vitro kinetiek van binding en dissociatie 1 bestuderen. De meeste labelvrije methoden immobiliseren een biomolecuul op een sensor oppervlak en gebruiken een optisch signaal om een bindende partner te detecteren uit de oplossing als het associeert met de geïmmobiliseerde biomolecuul 1. Terwijl SPR is een zeer gevoelige methode is gevoelig voor storingen als gevolg van veranderingen in de brekingsindex van de oplossing stroomt via sensor 2. Hoewel niet zo gevoelig als SPR, Bio-layer interferometrie (BLI) wordt minder beïnvloed door veranderingen in de samenstelling van de steekproef 1,3. BLI gebruikt glasvezel biosensoren dat een merkgebonden biocompatibele coating aan het uiteinde hebben. Het systeem hier gebruikte (Octet-RED96) bevat acht spectrofotometers. Wit licht wordt doorgesluisd naar een rij van sondes die bewegen op een robotarm. Lichtdetectors are opgepikt door de sondes en verplaatst naar een 96-wells plaat met monsters. Een van de doelmoleculen is geïmmobiliseerd op het oppervlak biosensor. Vervolgens sensoren worden verplaatst naar putjes die de bindingspartner in oplossing. BLI bewaakt associatie van de bindende partner met het geïmmobiliseerde molecuul, en vervolgens controleert dissociatie na het verplaatsen van de sensoren om oplossing zonder de bindende partner. Binding van moleculen aan de biosensor oppervlak leidt tot veranderingen in optische interferentie tussen lichtgolven die naar de spectrofotometers reflecteren vanuit een binnenoppervlak en de externe interface tussen sensor en oplossing. Deze veranderingen in storing kan worden gekwantificeerd en gebruikt om kinetische tarieven van de binding en dissociatie, zoals samengevat in de animatie van figuur 1 te bepalen.
We hebben BLI toegepast interacties tussen de katalytische complex van bacterieel ATP synthase en de ε subeenheid, die automatisch remmen het enzym te meten. ATP synthase is een membraan ingebedde roterende nanomotor die synthese en hydrolyse van ATP 4 katalyseert. De katalytische complex (F 1) kunnen worden geïsoleerd in een oplosbare vorm die werkt als een ATPase. Subeenheid ε twee domeinen: het N-terminale domein (NBD) is noodzakelijk voor een goede montage en functionele koppeling van het enzym, maar niet direct met de katalytische subeenheden, het C-eindstandige domein (CTD) kan het enzym remmen door interactie met meerdere katalytische subeenheden 5,6. Deze ε regulatie is specifiek voor bacteriële ATP synthases en wordt niet waargenomen in de mitochondriale homoloog. ATP synthase heeft zich ontpopt als een doelwit voor antibacteriële geneesmiddelen, zoals blijkt uit de recente goedkeuring van de FDA bedaquiline om resistente tuberculose 7 behandelen. Zo richten ε's remmende rol voor drug discovery kon antibiotica die niet de mitochondriale ATP synthase hoeft te remmen opleveren. Met de geïsoleerde katalytische complex (F1), εwordt een scheidbaar subeenheid. Echter, met ε gebonden aan V 1, de εCTD kan een dramatisch conformatieverandering ondergaan, gedeeltelijk ingevoegd in de centrale holte van het enzym en die een remmende toestand die waarschijnlijk direct 6,8 dissociëren. We maken gebruik van BLI om kinetiek van F 1 / ε binding en dissociatie te meten, en indirect, allosteric effecten van katalytische-ter-liganden op conformatie ε te onderzoeken.
In ons systeem, ε gekozen voor immobilisatie op het sensoroppervlak aangezien BLI-signaal (zoals SPR) gevoelig is voor de massa van de moleculen binden aan het oppervlak. De ε subeenheid kleine (~ 15 kDa) ten opzichte van de belangrijkste F1 complex (~ 347 kDa). Zo zal een grotere BLI signaal het gevolg zijn van binding van F 1 aan geïmmobiliseerd ε. Om toezicht te houden F 1 dissociatie, die kan erg traag, moet ε sterk worden geïmmobiliseerd. Dus kozen we biotinyleren, En immobiliseren van met streptavidine beklede biosensoren. Eiwitten kunnen worden gebiotinyleerd door (i) willekeurige modificatie van oppervlakte lysines 9, (ii) reactie van een unieke natieve of gemodificeerde cysteine met een biotine-maleïmide reagens 10 of (iii) toevoeging van een genetisch bepaalde biotine-acceptor peptide dat enzymatisch gebiotinyleerd tijdens in vivo expressie van het gelabeld eiwit 11. In ons systeem wordt ε gebiotinyleerd met de methode (iii) 8. Zodra-biotine gelabeld ε wordt geïmmobiliseerd op streptavidine sensoren, kan BLI meten van de binding en dissociatie van F 1 die is uitgeput van de subunit ε (F 1 (-ε)). Voor de hier beschreven experimenten, waren voorafgaande testen gedaan om redelijke hoeveelheden van het gebiotinyleerde eiwit vast te immobiliseren op de sensoren. Dit kan variëren, afhankelijk van het molecuulgewicht van het eiwit en zijn bindingspartner, maar het doel is om een minimale hoeveelheid geïmmobiliseerd proteïne t bepalenpet verschaft (i) voldoende signaal-ruis voor binding kinetiek met een lage concentratie van de bindingspartner (hierna K D) en (ii) een minimale verstoring van bindingskinetiek met bijna verzadigende concentratie van de bindingspartner. Ook kan stoichiometrie van biotinylering variëren (maar vermijd> 1 mol biotine / mol eiwit), zodat aanvankelijke test kan nodig zijn voor elke nieuwe partij gebiotinyleerd proteïne te bevestigen dat een consistente BLI verkregen kan worden bij immobilisatie op streptavidine-beklede sensoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Thans beschikbare instrumenten voor BLI toelaten belangrijke doorvoer en flexibiliteit in assays voor biomoleculaire interacties. Verschillende monsters oplossing wordt overgebracht in putjes van een zwarte microtiterplaat en een stel evenwijdige BLI sensoren geprogrammeerd heen en weer schakelen tussen kolommen van putten op de plaat. De monsters worden geroerd door orbitaal schudden gedurende de test. Het systeem hier gebruikt heeft 8 sensoren en gebruikt een 96-well plaat monster, maar een ander systeem gebruikt 16 s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken FortéBio voor het verschaffen grafieken in figuur 1. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie GM083088 aan TMD
Materials
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
Riferimenti
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes. Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).
- Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. The Enzymes. Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).
- Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).
- Cingolani, G., Duncan, T. M. Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation. Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).
- Mirsaeidi, M. After 40 years, new medicine for combating TB. Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).
- Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands. J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).
- Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface. J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).
- Loo, T. W., Clarke, D. M. Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).
- Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli. Gene. 169, 59-64 (1996).
- Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) – How Does it Work?. FortéBio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).
- Wartchow, C., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).
