タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法
Summary
ここプロトコルは、バイオレイヤー干渉法によるタンパク質 – タンパク質相互作用のカイネティックアッセイを記載する。細胞のエネルギー代謝に関与するF型ATP合成酵素、細菌中のεサブユニットによって阻害することができる。私たちは、εの阻害C末端ドメインと触媒の複合体の相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法を適応している。
Abstract
我々は、 大腸菌の ATP合成酵素の触媒複合体とサブユニットεの阻害相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法の使用を記載している。細菌のF型ATP合成酵素 薬剤耐性結核と闘うための新しい、FDA承認の抗生物質のターゲットである。サブユニットεのC末端ドメインによりATP合成酵素の細菌特有の自己阻害を理解することは、抗菌薬の発見のための酵素を標的とする新しい手段を提供することができます。 εのC末端ドメインは、アクティブ状態と非アクティブ状態、および触媒部位リガンドとの間の酵素の遷移が支配的であるεのコンフォメーションのどの影響を与えることができる劇的な構造変化を起こす。 εの結合/触媒複合体の解離、および間接的にMEAのアッセイは、動態sures明らかnondissociable阻害コンフォメーションとの間での酵素結合εのシフト。バイオレイヤー干渉信号は、溶液組成物に過度に敏感ではないので、それはまた、εのコンフォメーション変化に触媒部位リガンドのアロステリック効果をモニターするために使用することができる。
Introduction
タンパク質-タンパク質相互作用は、多くの生物学的プロセスのために重要であり、表面プラズモン共鳴（SPR）のようなラベルフリー光学的方法1の結合及び解離の動態を研究するためにインビトロで使用されてきた。ほとんどのラベルフリーの方法は、センサ表面上の1生体分子を固定化し、それが固定化された生体分子1と会合するように溶液から結合パートナーを検出するための光信号を使用しています。 SPRは、高感度な方法であるが、それは、センサ2の上を流れる溶液の屈折率の変化による干渉を受けやすい。 SPRほど敏感ではないが、バイオレイヤー干渉法（BLI）が少ないサンプル組成1,3の変化に影響される。 BLIは、先端に独自の生体適合性コーティングを有する光ファイババイオセンサーを使用しています。 （オクテットRED96）ここで使用されるシステムは、8つの分光光度計が含まれています。白色光は、ロボットアームに移動したプローブの行にパイプされる。光ファイバセンサのアルeは、プローブによってピックアップされたサンプルを含む96ウェルプレートに移動した。標的分子の一つは、バイオセンサー表面上に固定化される。次いで、センサは、溶液中の結合パートナーを含むウェルに移動される。 BLIは固定化された分子と結合パートナーとの会合を監視してから、結合相手なしでソリューションにセンサーを移動した後に解離を監視します。バイオセンサー表面への分子の結合は、内面からとセンサと溶液との間の外部インタフェースからの分光光度計に戻って反映させる光波の間の光の干渉の変化につながる。干渉におけるこれらの変化を定量化し、 図1のアニメーションにまとめたように、結合および解離の速度論的速度を決定するために用いることができる。
私たちは、酵素を自動阻害することができる細菌のATP合成酵素とそのεサブユニットの触媒複合体の間の相互作用を測定するために、BLIを適用している。 ATP SYnthaseは、ATP 4の合成と加水分解を触媒膜に埋め込 まれた回転ナノモーターである。触媒複合体（F 1）は、ATPアーゼとして機能する可溶性の形で単離することができる。サブユニットεは二つのドメインを持っている：N末端ドメイン（NTD）は適切な組み立てと、酵素の機能的結合のために必要であるが、触媒サブユニットと直接相互作用しない。C末端ドメイン（CTD）がと相互作用することによって酵素を阻害することができる複数の触媒サブユニット5,6。このε媒介規制は細菌のATP合成酵素に特有のものであり、ミトコンドリアの相同体で観察されていません。薬剤耐性結核7を治療するbedaquilineの最近のFDAの承認で示すように、ATP合成酵素は、抗菌薬のターゲットとして浮上している。これにより、創薬のためのεの阻害的役割を標的とすることは、ミトコンドリアATP合成酵素を阻害しない抗菌剤を得ることができる。孤立した触媒錯体（F 1）、εと解離性サブユニットになる。しかし、F 1に結合しているεで、εCTDは部分的に酵素の中央空洞内に挿入し、直接6,8解離性は低い抑制状態を形成し、劇的な構造変化を受けることができる。我々は、触媒サイトがεのコンフォメーション上のリガンドのアロステリック効果を調べるために、間接的にFが1 /ε結合と解離の反応速度を測定し、するBLIを使用しています。
（SPR等）BLI信号が表面に結合する分子の質量に敏感であるので、我々のシステムにおいては、εは、センサ表面に固定化するために選択した。 εサブユニットは、メインF 1複合体（〜347 kDa）の、小さな（〜15 kDa）の相対的です。このように、より大きなBLI信号が固定化されたεに、F 1の結合からなります。非常に遅くなることが、F 1解離を、監視するために、εは強く固定化されている必要があります。したがって、私たちは、ビオチン化することにしました、およびストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー上に固定。タンパク質は、表面リジン9の（I）のランダム変更、ビオチン-マレイミド試薬10または（iii）遺伝的に酵素的に中にビオチン化され、特定のビオチンアクセプターペプチドを付加した独自のネイティブまたはシステイン（II）の反応により、ビオチン化することができるタグ付けされた蛋白質11のin vivo発現における 。我々のシステムでは、εは法（III）8を使用してビオチン化する。ビオチンタグ化εストレプトアビジンセンサー上に固定化されると、BLI結合およびサブユニットε（F 1（-ε））を枯渇されたF 1の解離を測定することができる。ここに記載の実験のために、予備的アッセイは、センサー上に固定化するためにビオチン化タンパク質の合理的な量を決定することは行われていた。これは、タンパク質の分子量およびその結合パートナーに応じて、変えることができるが、目標は、固定化タンパク質tの最小量を決定することである帽子は、（i）許容信号対雑音（K D下）結合パートナーの濃度が低いと結合パートナーのほぼ飽和濃度との結合動態（II）の最小限の歪みで反応速度を結合するために用意されています。また、ビオチンの化学量論は一貫BLI信号は、ストレプトアビジン被覆上に固定化の間に達成することができることを確認するために変化する（ただし、> 1モルビオチン/モルタンパク質を避ける）ため、いくつかの初期のアッセイは、ビオチン化タンパク質のそれぞれ新しいロットのために必要とされてもよいセンサー。
Protocol
Representative Results
Discussion
BLIのための現在利用可能な機器は、生体分子の相互作用のためのアッセイにおいて有意なスループットと柔軟性を可能にします。種々の溶液試料は黒色マイクロタイタープレートのウェルに分配され、平行BLIセンサのセットは、プレート上のウェルの列の間を前後に移動するようにプログラムされる。サンプルは、アッセイを通じて軌道振とうにより撹拌する。ここで使用されるシステ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、図1で使用されるグラフィックスを提供するためFortéBioに感謝します。この作品は、TMDにNIHの助成金GM083088によってサポートされていました
Materials
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
Riferimenti
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes. Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).
- Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. The Enzymes. Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).
- Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).
- Cingolani, G., Duncan, T. M. Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation. Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).
- Mirsaeidi, M. After 40 years, new medicine for combating TB. Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).
- Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands. J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).
- Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface. J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).
- Loo, T. W., Clarke, D. M. Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).
- Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli. Gene. 169, 59-64 (1996).
- Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) – How Does it Work?. FortéBio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).
- Wartchow, C., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).
