단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭
Summary
여기에 프로토콜은 바이오 층 간섭과 단백질 – 단백질 상호 작용의 운동 분석을 설명합니다. 셀룰러 에너지 대사에 관여 F 형 ATP 합성 효소는, 세균에서의 ε 서브 유닛에 의해 억제 될 수있다. 우리는 ε의 억제 C-말단 도메인과 촉매 복합체의 상호 작용을 연구하는 바이오 층 간섭을 채택했다.
Abstract
우리는 대장균 ATP 합성 효소의 촉매 복합체 소단위 ε의 억제 작용을 연구하는 바이오 층 간섭계를 사용하는 방법을 설명한다. 세균성 F 형 ATP 신타 약물 내성 결핵에 대처하기 위해 새로운, FDA 승인 항생제의 대상입니다. 서브 유닛 ε의 C-말단 도메인에 의해 ATP 합성 효소의 이해 박테리아 별 자동 억제 항균 약물의 발견을위한 효소를 표적으로하는 새로운 방법을 제공 할 수있다. ε의 C-말단 도메인은 활성 및 비활성 상태 및 촉매 사이트 리간드 간의 전이 효소가 우세한 ε의 배좌의 영향을 미칠 수있는 극적인 형태 적 변화를 겪는다. 간접적으로 ε의 바인딩 / 촉매 복합과 분리하고, MEA의 분석 측정 반응 속도슈어 분명히 nondissociable 억제 형태 및에서 효소 결합 ε의 변화. 바이오 – 레이어 간섭 신호는 용액 조성물에 지나치게 민감하지이므로도 ε의 형태 적 변화에 촉매 사이트 리간드의 알로 스테 릭 효과를 모니터하는데 사용될 수있다.
Introduction
단백질 – 단백질 상호 작용은 많은 생물 학적 과정에 중요하며, 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 같은 레이블의 광학 방법은 1 바인딩과 해리의 속도를 연구하기 위해 체외에서 사용되어왔다. 대부분의 라벨없는 방법은 센서면에 하나의 생체 분자를 고정화하고 고정화 한 생체 분자와 연관로서 용액으로부터 바인딩 파트너를 검출하는 광 신호를 사용한다. SPR은 매우 민감한 방법이지만,이 때문에 센서 (2)를 통해 흐르는 용액의 굴절률 변화에 간섭하는 경향이있다. SPR 바이오 층 간섭계 (BLI)만큼 민감하지가 적은 샘플 구성 1,3의 변화에 의해 영향을받지 않는다. BLI는 끝 독점 생체 적합성 코팅이 광섬유 바이오 센서를 사용합니다. (진수 RED96) 여기에 사용 된 시스템에 8 개의 분광 광도계가 포함되어 있습니다. 흰색 빛이 로봇 팔에 이동 프로브의 행으로 파이프됩니다. 광섬유 센서는 아칸소전자는 프로브에 의해 포착 및 샘플을 포함하는 96 – 웰 플레이트로 옮겼다. 표적 분자 중 하나는 바이오 센서 표면에 고정된다. 그런 다음 센서 솔루션의 결합 파트너를 포함하는 우물로 이동합니다. BLI는 고정 된 분자와 결합 파트너의 연결을 모니터링하고 바인딩 파트너없이 솔루션에 센서를 이동 한 후 해리를 모니터링합니다. 바이오 센서의 표면에 분자의 결합은 내부 표면 및 센서 및 솔루션 사이의 외부 인터페이스에서 다시 분광 광도계에 반영하는 빛의 파장과 광 간섭의 변화로 연결됩니다. 간섭의 이러한 변화는 정량화 및도 1의 애니메이션에 요약 바인딩 및 해리의 운동 속도를 결정하는데 사용될 수있다.
우리는 촉매 세균 ATP 합성 효소의 복잡한 효소를 자동으로 억제 할 수는 ε의 서브 유닛 사이의 상호 작용을 측정하는 BLI를 적용했습니다. ATP 싸이nthase 합성 및 ATP 4의 가수 분해를 촉매 막 – 내장 된 회전을 nanomotor입니다. 촉매 복합체 (F 1) ATP 아제로 작동하는 수용성 형태로 분리 할 수있다. 소단위 ε는 두 도메인있다 : N-말단 영역 (NTD) 적절한 조립 및 효소의 기능적인 결합을 위해 필요하지만, 촉매 서브 유닛과 직접적으로 상호 작용하지 않고, C-말단 도메인 (CTD)에 상호 작용하여 효소를 억제 할 여러 촉매 서브 유닛 5,6. 이 ε – 중재 규정은 세균 ATP 합성 효소에 고유하며 미토콘드리아 상동에서 관찰되지 않습니다. 약물 내성 결핵 7을 치료하는 bedaquiline의 최근 FDA의 승인에 의해 도시로 ATP 합성 효소는, 항균 약물의 대상으로 떠오르고있다. 따라서, 약물 발견을위한 ε의 억제 역할을 대상으로하는 미토콘드리아 ATP 합성 효소를 억제하지 않는 항균제를 얻을 수 있습니다. 절연 촉매 착체 (F 1), ε와 함께해리 서브 유닛이됩니다. 그러나, F (1)에 바인딩 ε와 εCTD 부분적 효소의 중앙 공동 내로 삽입하고 직접 6,8 해리 가능성은 억제 상태를 형성 극적인 형태 적 변화를 겪을 수있다. 우리는 촉매 사이트는 ε의 형태에 대한 리간드의 알로 스테 릭 효과를 조사하기 위해, 간접적으로 F 1 / ε 결합과 해리의 반응 속도를 측정하는 BLI를 사용합니다.
우리의 시스템에서, ε는 (SPR 등) BLI 신호 이후 센서 표면에 고정화를 위해 선택 하였다는 표면에 결합 분자의 질량에 민감하다. ε 서브 유닛은 메인 F 1 단지 (~ 347 kDa의) 작은 (~ 15 kDa의)를 기준으로합니다. 따라서, 더 큰 BLI 신호는 고정 ε에 F 1의 결합에서 발생합니다. 매우 느릴 수 있습니다 F 1 해리를 모니터링하기 위해, ε 강하게 고정해야합니다. 따라서 우리는 biotinylate하기로 결정했습니다; 및 스트렙 타비 딘 – 코팅 된 바이오 센서를 이용하여 그것을 고정시킨다. 단백질 표면 리신 (9)의 (I)의 임의의 변형, 비오틴 – 말레이 미드 시약 (10) 또는 (ⅲ) 유전자 효소 중에 비오틴되는 특정 비오틴-수용체 펩티드 첨가와 고유 네이티브 또는 엔지니어링 시스테인 (II)의 반응에 의해 비오틴 수 태그 단백질 (11)의 생체 내 발현. 우리의 시스템에서, ε는 방법 (III) 8 사용 비오틴된다. 비오틴 태그 ε는 스트렙 타비 딘 센서에 고정되면, BLI는 바인딩과 서브 유닛 ε (F 1 (-ε))의 소진 된 F 1의 분리를 측정 할 수 있습니다. 여기 기재된 실험을 위해, 예비 분석은 센서에 고정화 바이오틴 단백질의 적당한 양을 결정하기 위해 수행되었다. 이 단백질의 분자량 및 그 결합 파트너에 따라 달라질 수 있지만, 목표는 고정화 단백질 t의 최소한의 양을 결정하는 것이다모자를 제공합니다 (I) 허용 신호 대 잡음 (K D 이하) 바인딩 파트너의 낮은 농도와 결합 파트너의 거의 포화 농도와 반응 속도를 결합 (II) 최소한의 왜곡과 반응 속도를 바인딩. 또한, 바이오 티 닐화의 화학 양론은 일관된 BLI 신호가 스트렙 타비 딘 – 코팅에 고정하는 동안 달성 될 수 있음을 확인하기 위해 변경 (만> 1 몰 비오틴 / 몰 단백질을 방지), 그래서 몇 가지 초기 분석은 바이오틴 단백질의 새 많이 필요 할 수도 있습니다 센서.
Protocol
Representative Results
Discussion
BLI에 대한 현재 사용 가능한 장비는 생체 분자의 상호 작용에 대한 분석에 상당한 처리량과 유연성을 허용합니다. 각종 용액 시료 블랙 마이크로 타이 터 플레이트의 웰에 분배하고, 병렬 BLI 센서 세트는 플레이트에 웰의 열 사이에서 앞뒤로 이동하도록 프로그램되어있다. 시료는 분석을 통해 궤도 흔들어 교반. 여기에 사용 된 시스템은 8 센서를 가지고 있으며, 96 웰 샘플 플레이트를 사용하지만…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그림 1에 사용 된 그래픽을 제공 FortéBio 감사합니다. 이 작품은 TMD에 NIH 교부금 GM083088에 의해 지원되었다
Materials
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
Riferimenti
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