Bio-skiktet interferometri för Measuring Kinetik för protein-proteininteraktioner och allosteriska Ligand Effekter
Summary
De protokoll som här beskriva kinetiska analyser av protein-proteininteraktioner med Bio-skiktet interferometri. F-typ ATP-syntas, som är involverat i cellenergimetabolism, kan hämmas av sin ε subenhet i bakterier. Vi har anpassat Bio-skiktet interferometri för att studera interaktioner av det katalytiska komplexet med ε s hämmande C-terminal domän.
Abstract
Vi beskriver användning av Bio-skiktet interferometri att studera hämmande interaktioner av subenhet ε med det katalytiska komplexet av Escherichia coli ATP-syntas. Bakteriell F-typ ATP-syntas är målet för ett nytt, FDA-godkända antibiotika för att bekämpa resistent tuberkulos. Förstå bakterie-specifika auto-hämning av ATP-syntas av C-terminal domän av subenhet ε kunde ge ett nytt sätt att rikta enzymet för upptäckten av antibakteriella läkemedel. Den C-terminala domänen av ε undergår en dramatisk strukturförändring när enzymet övergångar mellan den aktiva och inaktiva tillstånd, och katalytiskt-site-ligander kan påverka vilka av ε s konforma dominerar. Analysen mäter kinetik ε s bindning / dissociation med den katalytiska komplex, och indirekt meader den förskjutning av enzymbunden ε till och från som synes nondissociable inhiberande konformation. Bio-skiktet interferometri signalen inte är alltför känslig för lösningskomposition, så det kan också användas för att övervaka allosteriska effekter av katalytisk-site ligander på ε s konformationsförändringar.
Introduction
Protein-protein-interaktioner är viktiga i många biologiska processer, och märkningsfria optiska metoder såsom (Surface Plasmon Resonance, SPR) har använts in vitro för att studera kinetiken för bindning och dissociation 1. De flesta märkningsfria metoder immobilisera en biomolekyl på en sensoryta och använda en optisk signal för att detektera en bindningspartner från lösning eftersom den associerar med den immobiliserade biomolekyler 1. Medan SPR är en mycket känslig metod, är det utsatt för störning på grund av förändringar i brytningsindexet hos lösningen som strömmar över sensorn 2. Även om inte lika känsliga som SPR, Bio-lager Interferometry (BLI) påverkas mindre av förändringar i provets sammansättning 1,3. BLI använder fiberoptiska biosensorer som har en egen biokompatibel beläggning på spetsen. Det system som används här (Octet-RED96) innehåller åtta spektrofotometrar. Vitt ljus leds till en rad av sökfragment som rör sig på en robotarm. Fiberoptiska sensorer are plockas upp av sonderna och flyttade till en 96-brunnar innehåller prover. En av målmolekylerna är immobiliserad på biosensorytan. Då sensorerna är flyttade till brunnar innehållande bindningspartnern i lösning. BLI övervakar sammanslutning av bindningspartner med den immobiliserade molekylen, och sedan övervakar dissociation efter att ha flyttat sensorerna till lösning utan bindningspartner. Bindning av molekyler på biosensorytan leder till förändringar i optisk interferens mellan ljusvågor som speglar tillbaka till spektrofotometrar från en inre yta och från det externa gränssnittet mellan sensor och lösning. Dessa förändringar i interferens kan kvantifieras och användas för att bestämma kinetiska hastigheter av bindning och dissociation, såsom sammanfattas i animeringen enligt figur 1.
Vi har tillämpat BLI mäta samspelet mellan den katalytiska komplex av bakteriell ATP-syntas och dess ε subenhet, som kan automatiskt hämma enzymet. ATP SYnthase är ett membraninbäddade roterande nanomotor som katalyserar syntes och hydrolys av ATP 4. Den katalytiska komplexet (F 1) kan isoleras i en löslig form som fungerar som ett ATPas. Subenhet ε har två domäner: den N-terminala domänen (NTD) är nödvändigt för korrekt montering och funktionell koppling av enzymet, men inte interagera direkt med de katalytiska subenheter, den C-terminal domän (CTD) kan inhibera enzymet genom att interagera med flera katalytiska subenheter 5,6. Denna ε-medierad reglering är specifika för bakteriella ATP syntaser och är inte observerats i den mitokondriella homolog. ATP-syntas har vuxit fram som ett mål för antibakteriella läkemedel, vilket framgår av nyligen FDA godkännande av bedaquiline att behandla resistent tuberkulos 7. Således kunde måls ε s hämmande roll för drogupptäckt ge antibakteriella medel som inte inhiberar den mitokondriella ATP-syntas. Med den isolerade katalytiska komplexet (F 1), εblir en dissocierbar subenhet. Men med ε bundet till F 1, kan den εCTD genomgå en dramatisk strukturförändring, delvis insättning i enzymets centrala hålrum och bildar en hämmande tillstånd som sannolikt inte dissociera direkt 6,8. Vi använder BLI att mäta kinetiken för F 1 / ε bindande och dissociation, och indirekt, för att undersöka allosteriska effekter av katalytisk plats ligander på ε s konformation.
I vårt system, ε valdes för immobilisering på sensorytan sedan BLI signal (som SPR) är känslig för massan av de molekyler som binder till ytan. Det ε subenheten är liten (~ 15 kDa) i förhållande till huvud F 1-komplex (~ 347 kDa). Således kommer en större BLI signal leda till bindning av F 1 till immobiliserade ε. För att övervaka F 1 dissociation, vilket kan vara mycket långsam, måste ε vara starkt immobiliserade. Därmed valde vi att biotinylera, Och immobilisera den på streptavidinbelagda biosensorer. Proteiner kan biotinyleras genom (i) slumpmässig modifiering av yt lysiner 9, (ii) reaktion av en unik nativt eller manipulerade cystein med en biotin-maleimid-reagens 10 eller (iii) genetiskt lägga till en specifik biotin-acceptor-peptid som enzymatiskt biotinyleras under in vivo-uttryck av det taggade proteinet 11. I vårt system är ε biotinylerades med användning av metod (iii) 8. När biotin-märkt ε är immobiliserade på streptavidin sensorer, kan BLI mäta bindningen och dissociation av F 1 som har utarmats av subenhet ε (F 1 (-ε)). För de experiment som beskrivs här, hade preliminära analyser gjorts för att fastställa rimliga mängder av biotinylerade protein för att immobilisera på sensorerna. Detta kan variera beroende på molekylvikten hos proteinet och dess bindningspartner, men målet är att bestämma en minimal mängd immobiliserat protein thatt tillhandahåller (i) acceptabelt signal-till-brus för bindning kinetik med en låg koncentration av den bindande partnern (nedan K D) och (ii) minimal distorsion av bindande kinetik med nära-mättande koncentration av den bindande partnern. Dessutom kan stökiometri biotinylering variera (men undvika> 1 mol biotin / mol protein), så en del inledande analysen kan behövas för varje ny massa biotinylerat protein för att bekräfta att uppnås en enhetlig BLI signal under immobilisering på streptavidinbelagda sensorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
För närvarande tillgängliga instrument för BLI tillåter betydande kapacitet och flexibilitet i analyser för biomolekylära interaktioner. Olika lösningsprover fördelas i brunnar i en svart mikrotiterplatta, och en uppsättning parallella BLI sensorer är programmerade att flytta fram och tillbaka mellan kolumner av brunnar på plattan. Proverna rörs av orbital skakning genom hela analysen. Systemet som används här har åtta sensorer och använder en 96-brunnars provplatta, men ett annat system använder 16 se…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar FortéBio för att tillhandahålla bilder som används i figur 1. Detta arbete stöddes av NIH bidrag GM083088 till TMD
Materials
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
Riferimenti
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes. Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).
- Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. The Enzymes. Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).
- Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).
- Cingolani, G., Duncan, T. M. Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation. Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).
- Mirsaeidi, M. After 40 years, new medicine for combating TB. Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).
- Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands. J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).
- Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface. J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).
- Loo, T. W., Clarke, D. M. Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).
- Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli. Gene. 169, 59-64 (1996).
- Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) – How Does it Work?. FortéBio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).
- Wartchow, C., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).
