Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

Summary

Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.

Abstract

Descreve-se o uso de bio-camada de interferometria para estudar interacções inibidoras de subunidade ε com o complexo catalítico de Escherichia coli ATP sintase. Bacteriana tipo F ATP sintase é o alvo de um novo antibiótico, aprovado pela FDA para combater a tuberculose resistente a medicamentos. Compreender bactérias específicas auto-inibição da sintase do ATP pelo domínio C-terminal da subunidade ε poderia proporcionar um novo meio para a enzima alvo para a descoberta de medicamentos anti-bacterianos. O domínio C-terminal de ε sofre uma alteração conformacional dramática quando as transições de enzimas entre os estados activos e inactivos, e ligandos do local catalítico, que podem influenciar de conformações de ε é predominante. As medidas do ensaio de cinética de ε ligação / dissociação com o complexo catalítico, e indiretamente meamede a mudança de ε ligado a enzima para e a partir da conformação inibitória aparentemente nondissociable. O sinal de interferometria Bio-camada não é muito sensível para a composição da solução, de modo que também pode ser utilizado para monitorizar os efeitos alostéricos de ligandos do local catalítico de alterações conformacionais do ε.

Introduction

Interacções proteína-proteína são importantes para muitos processos biológicos, e métodos ópticos livre do rótulo como a superfície Plasmon Resonance (SPR) têm sido utilizados in vitro para estudar a cinética de ligação e de dissociação ^1. A maioria dos métodos sem rótulo imobilizar uma biomolécula em uma superfície do sensor e usar um sinal óptico para detectar um parceiro de ligação de solução, uma vez que se associa com a biomolécula imobilizada ^1. Enquanto SPR é um método altamente sensível, é propenso a interferências devido a mudanças no índice de refração da solução que flui sobre o sensor ^2. Apesar de não ser tão sensível quanto a SPR, Bio-camada Interferometria (BLI) é menos afetado por mudanças na composição da amostra ^1,3. BLI usa biossensores de fibra óptica que têm um revestimento biocompatível proprietária na ponta. O sistema utilizado aqui (Octeto-RED96) contém oito espectrofotômetros. A luz branca é canalizada para uma linha de sondas que se movem em um braço robótico. Sensores de fibra óptica are captado pelas sondas e mudou-se para uma placa de 96 poços contendo amostras. Uma das moléculas alvo é imobilizado na superfície do biossensor. Em seguida, os sensores são movidos para cavidades contendo o parceiro de ligação em solução. BLI monitora associação do parceiro de ligação com a molécula imobilizada e depois monitora dissociação depois de se mudar os sensores de solução sem o parceiro de ligação. A ligação de moléculas de superfície do biossensor leva a alterações na interferência óptica entre ondas de luz que reflectem para trás para os espectrofotómetros a partir de uma superfície interna e externa a partir da interface entre o sensor e solução. Estas alterações na interferência pode ser quantificado e utilizado para determinar as taxas cinéticas de ligação e de dissociação, tal como resumido na animação da figura 1.

Temos aplicado BLI para medir as interacções entre o complexo catalítico da ATP sintase bacteriana e sua subunidade ε, o qual pode auto-inibir a enzima. ATP synthase é um nanomotor rotativo encaixado à membrana que catalisa a síntese e hidrólise de ATP ^4. O complexo catalítico (F ₁₎ pode ser isolado de uma forma solúvel que funciona como uma ATPase. Subunidade ε tem dois domínios: o domínio N-terminal (NTD) é necessário para a montagem correcta e acoplamento funcional da enzima, mas não interagem directamente com as subunidades catalíticas; do domínio C-terminal (CTD) pode inibir a enzima, interagindo com várias subunidades catalíticas ^5,6. Esta regulação mediada por ε é específico para ATP sintases bacterianas e não se observa no homólogo mitocondrial. ATP sintase emergiu como um alvo para drogas antibacterianas, como mostrado pela recente aprovação do FDA bedaquiline no tratamento da tuberculose resistente aos medicamentos ^7. Assim, visando papel inibitório da ε para a descoberta da droga poderia render antibacterianos que não inibem a ATP sintase mitocondrial. Com o complexo catalítico isolado (F _1), εtorna-se uma subunidade dissociáveis. No entanto, com ε ligado a M _1, o εCTD pode sofrer uma alteração conformacional dramática, parcialmente inserção na cavidade central da enzima e formando um estado de inibição, que é pouco provável que se dissociam directamente ^6,8. Usamos BLI para medir cinética de F ₁ / ε ligação e dissociação, e indiretamente, para examinar os efeitos alostéricos do local catalítico ligantes na conformação de ε.

No nosso sistema, ε foi escolhido para a imobilização na superfície do sensor, uma vez sinal BLI (como SPR) é sensível à massa das moléculas de ligação à superfície. A subunidade ε é pequena (~ 15 kDa), em relação ao principal complexo F ₁ (~ 347 kDa). Assim, um sinal de BLI maior irá resultar da ligação de F ₁ a ε imobilizada. A fim de monitorar F ₁ de dissociação, o que pode ser muito lenta, ε deve ser fortemente imobilizada. Assim, optou-se por biotinilarE imobilizá-la em biossensores revestidas com estreptavidina. As proteínas podem ser biotinilada por (i) a modificação aleatória de lisinas da superfície ^9, (ii) a reacção de uma cisteína nativa única ou engenharia com um reagente biotina-maleimida ^{de 10} ou (iii) a adição de um péptido geneticamente biotina-receptor específico que é enzimaticamente biotinilado durante expressão in vivo da proteína marcada ^11. No nosso sistema, ε é biotinilado utilizando método (iii) ^8. Uma vez ε marcado com biotina, está imobilizado sobre sensores estreptavidina, BLI pode medir a ligação e dissociação do F ₁ que foi esvaziada da subunidade ε (F ₁ (-ε)). Para as experiências aqui descritas, os ensaios preliminares foram feitos para determinar quantidades razoáveis ​​de proteína biotinilada para imobilizar sobre os sensores. Isto pode variar, dependendo do peso molecular da proteína e do seu parceiro de ligação, mas o objectivo é o de determinar uma quantidade mínima de proteína imobilizada tchapéu fornece (i) aceitável sinal-ruído para a cinética de ligação com uma baixa concentração do parceiro de ligação (abaixo K _D) e (ii) uma distorção mínima de cinética de ligação com a concentração de quase saturação do parceiro de ligação. Além disso, a estequiometria de biotinilação pode variar (mas evitar> 1 mol biotina / proteína mol), de modo algum ensaio inicial pode ser necessário para cada novo lote de proteína biotinilada para confirmar que um sinal consistente BLI pode ser alcançada durante a imobilização da estreptavidina-revestida sensores.

Protocol

1. Programação do Instrumento de BLI Assay Ligue o instrumento pelo menos uma hora de antecedência para permitir que a lâmpada para aquecer, o que é necessário para minimizar o ruído e deriva em sinal óptico durante o experimento. Regule a temperatura desejada por meio da guia instrumento para pré-aquecimento do suporte da placa de amostra. Em seguida, criar o projeto experimental no software de aquisição de dados. Selecione "New Kinetics Experiment" na guia Assisten…

Representative Results

Ligação em tempo real e da cinética de dissociação BLI são mostrados na Figura 3. Esta experiência foi feita com tampão de ensaio de associação e dissociação. Esta experiência foi iniciada com um passo da linha de base de 10 minutos uma vez que os sensores foram prewet apenas brevemente. Em seguida, ε biotinilado foi carregado sobre os sensores. No dissociação detectável de ε ocorreu em todas as etapas restantes, como visto a partir da curva de referência (G) que não tinha parceiro d…

Discussion

Instrumentos actualmente disponíveis para BLI permitir a produção e flexibilidade significativa nos ensaios para interacções biomoleculares. Várias amostras de solução são dispensados ​​em poços de uma placa de microtitulação preto, e um conjunto de sensores BLI paralelas são programados para se mover para trás e para a frente entre as colunas de poços na placa. As amostras são agitadas por agitação orbital durante todo o ensaio. O sistema utilizado aqui tem oito sensores e usa uma placa de amostra…

Materials

Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available