न्यूक्लीओसाइड Triphosphates - संश्लेषण से बायोकेमिकल विशेषता को
Summary
यहाँ बताया प्रोटोकॉल संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates के लिए प्रमुख जटिल मार्ग के रास्ते में कई बाधाएं समझा और संक्षेपण करना है. नतीजतन, इस प्रोटोकॉल इन सक्रिय इमारत ब्लॉक के संश्लेषण और व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए उनकी उपलब्धता दोनों की सुविधा.
Abstract
रासायनिक functionalities के परिचय के लिए पारंपरिक रणनीति नवजात श्रृंखला के लिए उपयुक्त संशोधन phosphoramidite व्यापारियों जोड़कर ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग है. हालांकि, बल्कि कम दृश्यों के लिए संश्लेषण और प्रतिबंध के दौरान इस्तेमाल की स्थिति में इस पद्धति के लागू बाधा हैं. दूसरी ओर, संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates न्यूक्लिक एसिड, व्यावहारिक अनुप्रयोगों के एक व्यापक पैलेट में संशोधित न्यूक्लिक एसिड के उपयोग के लिए मार्ग प्रशस्त कि एक रणनीति में कई कार्य समूहों के हल्के परिचय के लिए नियोजित किया गया है कि इमारत ब्लॉकों सक्रिय कर रहे हैं ऐसे ribozymes और DNAzymes के कार्यात्मक टैगिंग और पीढ़ी के रूप में. प्रमुख चुनौतियों में से एक इन न्यूक्लीओसाइड analogues के अलगाव और लक्षण वर्णन करने के लिए अग्रणी पद्धति की जटिलता में रहता है.
इस वीडियो लेख में, हम thes के संश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेशई फॉस्फोरस (तृतीय) आधारित अभिकर्मकों का उपयोग analogues संशोधित. इसके अलावा, उनके जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए प्रक्रिया प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं और TdT पीछा polymerization पर एक विशेष जोर देने के साथ, खुलासा है. यह विस्तृत प्रोटोकॉल संशोधित dNTPs की क्राफ्टिंग और रासायनिक जीवविज्ञान में उनके आगे उपयोग के लिए काम का हो जाएगा.
Introduction
5'न्यूक्लीओसाइड triphosphates ((डी) NTPs) ऊर्जा के सार्वभौमिक मुद्रा होने से सेल चयापचय के नियामकों को लेकर अनगिनत प्रक्रियाओं और कार्यों में शामिल कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण biomolecules के एक वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन मौलिक जैविक परिवर्तनों में उनकी भूमिका के अलावा, उनके संशोधित समकक्षों oligonucleotides में कार्य समूहों की शुरूआत के लिए एक बहुमुखी और हल्के मंच, अच्छी तरह से आमतौर पर 1,2 लागू किया जाता है कि स्वचालित ठोस चरण संश्लेषण पूरक एक पद्धति के रूप में उन्नत किया है. दरअसल, (घ) NTPs आरएनए और डीएनए पीसीआर 3 के लिए substrates, अमीनो एसिड 4-13, boronic एसिड 14,15, nornbornene 16, diamondoid तरह के अवशेष 17, के लिए पक्ष की चेन सहित कार्य समूहों की एक धन के रूप में कार्य कर सकते हैं प्रदान की organocatalysis 18, पित्त अम्ल 19, और यहां तक कि oligonucleotides 20 oligonucleotides में पेश किया जा सकता है.
_content "> न्यूक्लिक एसिड की functionalization के लिए एक सुविधाजनक वेक्टर का प्रतिनिधित्व करने के अलावा, संशोधित dNTPs, SELEX और संशोधित उत्प्रेरक न्यूक्लिक एसिड 21-30 और विभिन्न व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए 10 aptamers की पीढ़ी के लिए इन विट्रो चयन के अन्य संबंधित मिश्रित तरीकों में लगे हुए किया जा सकता है 31-36. संशोधित dNTPs के polymerization से पेश कर रहे हैं कि अतिरिक्त पक्ष की चेन एक चयन प्रयोग के दौरान पता लगाया और न्यूक्लिक एसिड 37 के बजाय गरीब कार्यात्मक शस्त्रागार के पूरक हो सकते हैं कि रासायनिक अंतरिक्ष में वृद्धि करने के लिए लगा रहे हैं. हालांकि, इन के बावजूद आकर्षक लक्षण और सिंथेटिक और विश्लेषणात्मक तरीकों दोनों के विकास में किए गए हाल की प्रगति, कोई सार्वभौमिक रूप से लागू करने और अधिक उपज वाली प्रक्रिया संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates 2,38 के क्राफ्टिंग के लिए मौजूद है.इस वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य (कभी कभी) जटिल प्रक्रियाओं के प्रमुख टी में प्रकाश डाला हैओ संश्लेषण और इन सक्रिय इमारत ब्लॉकों (चित्रा 1 बी) के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन. विशेष जोर अक्सर मुश्किल से मिल रहे हैं या प्रयोगात्मक वर्गों में अनुपस्थित रहे हैं लेकिन शुद्ध (डी) NTPs के अलगाव (चित्रा 1) के प्रमुख के लिए सिंथेटिक मार्ग के सफल समापन के लिए अभी तक महत्वपूर्ण हैं कि सभी कृत्रिम विवरण पर दिया जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूक्लिक एसिड में संशोधनों को शामिल किए जाने antisense और antigene एजेंटों के विकास 42,43, लेबलिंग और oligonucleotides 41 के कार्यात्मक टैगिंग सहित कई व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए ब्याज की है, और आनुवंशिक वर्णमाला 44…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान n PZ00P2_126430 / 1 ° और PZ00P2_144595) द्वारा समर्थित किया गया. प्रो सी. Leumann कृतज्ञता अंतरिक्ष प्रयोगशाला और उपकरण उपलब्ध कराने, साथ ही उनके निरंतर समर्थन के लिए के लिए स्वीकार किया है. सुश्री मुकदमा Knecht उपयोगी विचार विमर्श के लिए स्वीकार किया है.
Materials
| tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| Biochemical reagents | |||
| g-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo–) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Equipment | |||
| Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| Oligonucleotides | |||
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: | |||
| Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330 | |||
| Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F. |
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