Den ekstracellulære matrix undergår en væsentlig ombygning i løbet af sårheling, inflammation og tumorigenesis. Vi præsenterer en roman intravital immunfluorescensmikroskopi tilgang til at visualisere dynamikken i fibrillar samt mesh-lignende matrix komponenter med høj rumlig og tidsmæssig opløsning ved hjælp af epifluorescens eller to-foton mikroskopi.
Udover at være et fysisk stillads at opretholde vævsmorfologi, er den ekstracellulære matrix (ECM) aktivt involveret i reguleringen af celle-og vævs funktion under udvikling og orgel homøostase. Det gør den ved at handle via biokemiske, biomekaniske og biofysiske signalveje, såsom gennem frigivelse af bioaktive ECM protein fragmenter, regulering væv spænding, og give veje for celle migration. Den ekstracellulære matrix af tumormikromiljøet undergår en væsentlig ombygning, kendetegnet ved nedbrydning, aflejring og organisering af fibrillære og ikke-fibrillære matrix-proteiner. Stromal afstivning af tumormikromiljøet kan fremme tumorvækst og invasion, og forårsage omdannelse af blod-og lymfekar. Levende billeder af matrix proteiner imidlertid at dette punkt er begrænset til fibrillære collagener der kan påvises ved anden harmonisk generation ved hjælp af multi-foton mikroskopi, forlader størstedelen af matrixkomponenter largely usynlig. Her beskrives procedurer for tumorinoculation i tynde dorsale øre hud, immunolabeling af ekstracellulære matrixproteiner og intravital billeddannelse af det eksponerede væv i levende mus ved hjælp af epifluorescens og to-foton mikroskopi. Vores intravital billeddannelse fremgangsmåde giver mulighed for direkte detektion af både fibrillært og ikke-fibrillære matrix-proteiner i forbindelse med en voksende dermal tumor. Vi viser eksempler på fartøj remodeling forårsaget af lokal matrix sammentrækning. Vi fandt også, fibrillære matrix af tumoren detekteres med den anden harmoniske generation er rumligt adskilt fra nyligt deponerede matrixkomponenter såsom tenascin C. Vi viste også på lang sigt (12 timer) billeddannelse af T-celle-interaktion med tumorceller og tumorceller migration langs collagen IV basalmembran. Tilsammen denne metode entydigt giver mulighed for samtidig påvisning af tumorceller, deres fysiske mikromiljø og den endogene immunrespons væv over tid, hvilket kan provIDE vigtig indsigt i de mekanismer, der ligger til grund tumor progression og ultimative succes eller resistens over for behandlingen.
Intravital billeddannelse af inflammatoriske, metastatisk og matrix remodeling processer har været et vigtigt område for forskning og har motiveret oprettelsen af talrige transgene reporter musemodeller, der udtrykker fluorescerende proteiner 1,2. På grund af out-of-fokus fluorescerende signaler, som reducerer billedkvalitet og grænser lysgennemtrængning gennem vævet, billedbehandling tyk væv er kun muligt med konfokal eller multi-foton scanning mikroskopi 3.. Ved hjælp af hurtigere, billigere og kompleks epifluorescens mikroskopi er kun muligt med næsten todimensionelle væv såsom kylling Chorio-allantois membran 4 eller museøre dermis 5. De fleste billeddannende systemer drage fordel af transgene mus, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner i en celletype-specifik måde. Selvom disse proteiner giver svage fototoksicitet de inducerer immunrespons 6. Desuden er det vanskeligt at skifte mellem specifikke celle undertyper eller markereir basal eller aktiverede stater som sådan ændring kræver, at udarbejdelsen af en ny genetisk model. Hertil kommer, fluorescerende protein-ekspression er generelt begrænset til intracellulære rum, er det normalt ikke muligt at billedet ekstracellulære strukturer som basalmembranproteiner eller væv chemokine indskud 7. I stedet indirekte mærkning med antistoffer mod ekstracellulære antigener giver fleksibilitet til stort set alle celle-type eller matrix specifik komponent 8,9. Men den største ulempe ved denne mærkning tilgang forbundet med immuntoksicitet medieret af antigen-antistof-immunkomplekser, der kan udløse komplementsystemet cellemedieret toksicitet og fagocytose af celler og extracellulære strukturer 10.
Den ekstracellulære matrix af tumormikromiljøet, men også af normalt væv under inflammation eller sårheling undergår en væsentlig ombygning. Stromal afstivning af tumormikromiljøet kan promote tumorvækst og invasion på grund af stress-induceret signalering mekanismer og forårsage omdannelse af blod-og lymfekar 11. Dog er levende billeder af matrix proteiner begrænset til fibrillære collagener der kan påvises ved anden harmonisk generation ved hjælp af multi-foton mikroskopi. For nylig har vi udgivet en roman intravital billedbehandling metode, der minimerer risikoen for foto-og immun-giftige beskadigelse filmede celler og vævsstrukturer 5. I sammenligning med etablerede billeddiagnostiske teknikker, hvor enkelt runde kontinuerlig intravital visualisering er i et interval på 30 minutter til 2 timer 12-17, vores intravital immunfluorescens (IF) teknik tilladt 12 timer (langsigtede 8) billeddannelse. Det er vigtigt at bemærke, at imaging tid er begrænset til 12 timer på grund af grænserne i vores dyr protokol, men der er ingen tekniske counter-tegn på, at det ikke kan forlænges, hvis de kritiske sundhedsmæssige parametre af dyret, som blodtryk og hjertesats styres 8. Hertil kommer, ved hjælp af en automatiseret fluorescens stereomikroskop vi var i stand til at indsamle billeder fra flere felter i løbet af et enkelt eksperiment og observerede sjældne immunologiske og remodeling processer, der fandt sted i den fysiologiske sammenhæng i huden understøttes af funktionelle blod og lymfe-fartøjer. Fordi stereomikroskopisk linse har en forholdsvis stor, 2 cm,-afstand og i modsætning til to-foton mikroskopiske optik kræver ikke fordampe nedsænkning i vand blev langsigtet billeddannelse udført kun under fluorescens stereomikroskop. Intravital IF tilladt immun mærkning og detektion af enhver ekstracellulære matrix komponent af normal hud. Udformningen af denne teknik er baseret på den innovative begrebet ved hjælp af immunfarvning for levende celler og væv matrix elementer på kirurgisk eksponerede mus dermis uden at forårsage skadelige immunotoksiske virkninger 5.. Den kirurgiske procedure selv er sikkert at dermisvasculature da det kun er afhængig af adskillelsen af to hudlag i øret, som er uafhængigt innerverede, autonomt fodret af blod og drænet af særskilte lymfe oplag. Vores forsøgsopstilling tillader scanning af en række vigtige patofysiologiske begivenheder over mindst 12 timer, herunder leukocyttrafik mellem blod og lymfekar og sårheling processer. I den oprindelige publikation vi sammenlignet vores teknik til state-of-the-art standarder i forskellige områder af intravital billeddannelse. Derfor observerede vi blodkar ekstravasation og lymfe intravasation begivenheder ved forskellige typer af leukocytter, herunder den unikke visualisering af immunceller ind i stedet for at indsamle forventede indledende lymfekar 15. Også supplere de observationer udført af andre grupper 9,18, fandt vi, at in vivo CCL21 er i stand til at danne stærke, diskontinuerte indskud på indsamling, men kun sjældent om de første lymfevejene.
<p class = "jove_content"> Her beskriver vi en modificeret intravital IF teknik, der kan kombineres med to-foton mikroskopi til påvisning af netværk af fibrillære collagener ved hjælp af anden harmoniske generation (SHG). Vi viser, at denne metode også kan anvendes til billeddannelse cancercelleinvasion i forbindelse med den dynamiske tumormikromiljøet, som omfatter matrix-molekyler såsom tenascin C, som er stort set uudforsket af nuværende billeddannelsesteknikker 19. Vi fandt, at fibrillære matrix af tumor, detekteret med den anden harmoniske generation, indtager forskellige steder i tumormikromiljøet end den nyligt deponerede matrix sammensat af tenascin C. Desuden beskriver vi eksempler på fartøjet remodeling forårsaget af lokal matrix sammentrækning, lang sigt (12 timer) billeddannelse af T-celle-interaktioner med tumorceller og tumorcellemigration langs collagen IV basalmembranen. Sådanne arrangementer kan afbildes samtidig optager lokale fysiologiske parametre såsom blodkarrenes permeability og lymfedrænage.Betydning
Her præsenterer vi en ny intravital mikroskopi tilgang, der tillader høj opløsning og dynamisk visualisering af forskellige væv microenvironment komponenter, herunder fibrillar samt mesh-lignende matrix proteiner. Denne fremgangsmåde har flere fordele i forhold til de nuværende intravital billeddannende teknikker: (i) Intravital fluorescensimagografi har været anvendt i mikrocirkulationen undersøgelser, fx for at spore opløste lækage af blod eller i lymfekar, men er ikke blevet kombineret med immunfarvning. (Ii) anvendelse af genetisk modificerede reporter mus giver mulighed for specifikke celletyper, der skal afbildes, men kræver deres tilgængelighed (eller en væsentlig indsats for at skabe nye) og begrænser antallet af interagerende celletyper, der kan studeres. (Iii) Ekstracellulær matrix kan afbildes in vivo ved hjælp af anden harmoniske generation, men denne teknik kan kun afsløre fibrøse collagener, hvilket efterlader et stort antal vigtige ekstracellulære komponentersåsom kælderen membraner, fibronectiner, tenasciner, vækstfaktorer, kemokiner og væv glycosaminoglycans uden for rækkevidde for aktuel forskning. Vores metode overvinder disse begrænsninger, og giver standard billeddannende teknikker skal indarbejdes, og yderligere kombineres med immunostainings for andre celletyper, vævsstrukturer, aflejringer af heparinsulfat bindende vækstfaktorer (f.eks VEGF 26) og chemokiner (CCL21 5,18 og fig. 2D ), eller ekstracellulære matrixproteiner samtidig sporing blod og / eller lymfe-flow.
Begrænsninger
Den epifluorescence billeddannelse af intravital IF er begrænset til de tynde hudlapper, berøvet tykke underhuden (fedtvæv). Mens vi fundet, at de dorsale øre dermis er optimal for relativt harmløse kirurgisk fremstilling af øret huden epifluorescens med intravital IF teknik ikke er begrænset til øre dermis og kan potentielt anvendes til fxblottet hud af tæer eller rygskindet af nyfødte mus. Rapid antistoffarvning (15 minutter) i immunofluorescens IF er ikke afhængig af passiv diffusion, men kræver funktionel lymfedrænage og fluidstrømning interstitiel dermed kan observeres nogen farvning hvis lymfekar okkluderes 27. I tråd med det, lymfekar pletten stærkere så utæt blod vasculature (tilskadekomne skibe, arterioler) 5. Adskillelsen af den dorsale og ventrale øre hudlapper er en mild kirurgisk procedure, men det forårsager skade på visse kapillærer og celledød til forskellige vævsceller. Dette kan være et problem, når man skal undersøge helt intakt væv, fx ser på den milde af lægemidlers virkning på celleoverlevelse. Også anvendelsen af antioxidant, der tjener til at beskytte huden mod fototoksicitet og fotoblegning udelukker brugen af intravital immunfluorescens teknik til at undersøge fx vævet oxidativt stress eller nitrogenoxid biologisty.
Endelig kan aktivere disse celler og indflydelse fx undersøgelse af respons væv immune og dendritisk celleaktivering blinding af væv residente makrofager med immunkomplekser.
Ændringer og fejlfinding
For at studere væv oxidativt stress eller nitrogenoxid biologi, ascorbat skal udskiftes med andre væv kompatible medier, der ikke interfererer med den eksperimentelle output. Tilsvarende bør blokerer Fc receptorer på dermal immunceller undgås, hvis målet med undersøgelsen er den funktion og aktivering af reaktion vævet immun og dendritiske celle aktivering og migration. Dette kan gøres ved anvendelse af sekundært antistof med Fc-fragmentet spaltet (F (ab) 2-antistoffragmenter), eller anvendelsen af biotinyleret antistof og fluorescerende streptavidin som detekteringsreagenser.
Fremtidige anvendelser
Vi præsenterer et nyt og unikt intraafgørende, hvis teknik til billed-ikke-fibrillære komponenter af ekstracellulær matrix i transplanterbare hudtumorer i kombination med SHG-opdaget fibrillar og modnet collagener hjælp af to-foton mikroskopi. En af fordelene ved at anvende multi-foton (eller konfokal) mikroskopi løbet epifluorescens billeddannelse er z-stabling mulighed og følgelig rumlig co-lokalisering af begivenheder inden ekstracellulære matrix, fx tumor intravasation i lymfe eller blodkar, som i tilfælde af standard epifluorescens mikroskopi kun kan udledes morfologiske ændringer af den invaderende celle. Denne teknik har langt bredere potentiale. For eksempel har vi brugt intravital IF til at undersøge den mekanisme af lymfatisk okklusion af lymfe-specifikke fotodynamisk terapi 27. Yderligere mulige anvendelser af denne metode omfatter, men er ikke begrænset til undersøgelse af hudens immunitet under inflammation, mekanisme afstødning eller metoder til blod og lymfe ATIC fartøj vækst i løbet tumorigenesis.
Kritiske trin i proceduren
Det vigtigste skridt, der har afgørende konsekvenser for at opretholde et fysiologisk væv miljø er en kirurgisk adskillelse af den ventrale hud og brusk fra ryg dermis. Skæring eller tilstoppe den store pulsåre eller vene vil føre til overdreven blødning og lokal vævshypoxi, hvilket vil påvirke cellulære respons på behandlinger og cellebevægelse 8. Immobilisere øret med kirurgisk lim bør ske med forsigtighed, da spilde limen på eksponere væv vil medføre en permanent skade på vævet ved tillukning af blodkar. Temperaturen af musen skal kontrolleres og holdes ved 37 ° C. Derudover befugtet oxygen skal anvendes til isofluran anæstesi, således at øjne og lunger blive ordentligt befugtet under eksperimentet. Desuden skal natriumascorbat fremstilles frisk, og dens pH kontrolleres før brug.
ntent "> Sammenfattende denne intravital immunfluorescens bro real-time, lokale målinger af fysiologiske funktion med molekylær billeddannelse af komplekse cellulære begivenheder i mus huden. Desuden er denne metode har et stort potentiale, da det let kan anvendes til fx studie post-udviklingsmæssige mekanismer for blod og lymfe-angiogenese eller at visualisere de tidlige faser af hudinfektion af forskellige patogener. Med sin fleksibilitet og high-throughput potentiale, kan denne intravital teknik bidrage væsentligt til flere områder af biologi.The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for Jeremy CM Teo og S. Ryan Oliver for deres bidrag og Jolanta Kilarska om hjælp til billedbehandling. Vi takker BIOP core facilitet på EPFL for støtte med to-foton mikroskopi
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd Kommissionen (DC-lymfe, 206.653-2), den europæiske referenceramme for Projekt 7 (AngioScaff), den schweiziske National Science Foundation (31-135.756), og det amerikanske National Institutes of Health (NIH) / NIH Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI) (RO1 HL096539). Derudover midler fra Robert Wenner Award (schweizisk Cancer League) tilladt købet Leica stereomikroskopet anvendt i denne undersøgelse. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |