बाह्य मैट्रिक्स घाव भरने, सूजन और tumorigenesis दौरान पर्याप्त remodeling आए. हम तंतुमय की गतिशीलता के साथ ही epifluorescence या दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान के साथ जाल की तरह मैट्रिक्स घटकों कल्पना करने के लिए एक उपन्यास intravital immunofluorescence माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं.
ऊतक आकारिकी बनाए रखने के लिए एक शारीरिक पाड़ होने के अलावा, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सक्रिय रूप से विकास और अंग homeostasis के दौरान सेल और ऊतक समारोह को विनियमित करने में शामिल है. यह bioactive ईसीएम प्रोटीन टुकड़े की रिहाई के माध्यम से इस तरह के रूप में, जैव रासायनिक biomechanical, और biophysical संकेत दे रास्ते के माध्यम से अभिनय ऊतक तनाव को विनियमित करने, और सेल प्रवास के लिए रास्ते प्रदान करके ऐसा करता है. ट्यूमर microenvironment के बाह्य मैट्रिक्स गिरावट, बयान और तंतुमय और गैर तंतुमय मैट्रिक्स प्रोटीन की संगठन द्वारा विशेषता पर्याप्त remodeling, आए. ट्यूमर microenvironment की stromal stiffening ट्यूमर के विकास और आक्रमण को बढ़ावा देने, और रक्त और लसीका वाहिकाओं के पुनर्गठन पैदा कर सकता है. मैट्रिक्स प्रोटीन की लाइव इमेजिंग, हालांकि, इस बात के लिए मैट्रिक्स घटकों के बहुमत एल छोड़ने, बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी से पता लगाया जा सकता है कि तंतुमय कोलेजन तक सीमित हैargely अदृश्य. यहाँ हम बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और epifluorescence और दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग रहते चूहों में उजागर ऊतक की intravital इमेजिंग के immunolabeling, पतली पृष्ठीय कान त्वचा में ट्यूमर टीका के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. हमारे intravital इमेजिंग विधि एक से बढ़ त्वचीय ट्यूमर के संदर्भ में तंतुमय और गैर तंतुमय मैट्रिक्स प्रोटीन दोनों की प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है. हम स्थानीय मैट्रिक्स संकुचन के कारण पोत remodeling के उदाहरण दिखाते हैं. हम भी दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी के साथ पाया ट्यूमर का तंतुमय मैट्रिक्स हम भी ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के साथ टी सेल बातचीत की लंबी अवधि (12 घंटे) इमेजिंग से पता चला है ऐसे tenascin सी के रूप में नव जमा मैट्रिक्स घटकों से स्थानिक अलग है कि पाया तहखाने झिल्ली के कोलेजन चतुर्थ साथ माइग्रेशन. साथ में ले ली, इस विधि अनोखे prov सकता है जो ट्यूमर कोशिकाओं के साथ पता लगाने, उनकी शारीरिक microenvironment और समय के साथ अंतर्जात ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, के लिए अनुमति देता हैट्यूमर प्रगति और अंतिम सफलता या उपचार के लिए प्रतिरोध अंतर्निहित तंत्र में आईडीई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि.
भड़काऊ, metastatic और मैट्रिक्स remodeling प्रक्रियाओं के intravital इमेजिंग अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र रहा है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन 1,2 व्यक्त कि कई ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मॉडल के निर्माण के लिए प्रेरित किया है. कारण छवि गुणवत्ता को कम करने और सीमा के ऊतकों के माध्यम से प्रवेश जो प्रकाश बाहर का ध्यान केंद्रित फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए, इमेजिंग मोटी ऊतक केवल confocal या बहु फोटॉन स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी 3 के साथ संभव है. तेजी का उपयोग करना, कम खर्चीला और जटिल epifluorescence माइक्रोस्कोपी केवल ऐसे चिकन Chorio-अपरापोषिकीय झिल्ली 4 या माउस कान डर्मिस 5 के रूप में लगभग दो आयामी ऊतकों के साथ संभव है. अधिकांश इमेजिंग सिस्टम एक सेल प्रकार विशिष्ट फैशन में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का लाभ ले. इन प्रोटीनों कमजोर phototoxicity की पेशकश हालांकि, वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6 प्रेरित. इसके अलावा, यह विशेष सेल उपप्रकार के बीच स्विच या चिह्नित करने के लिए मुश्किल हैइस तरह के परिवर्तन के रूप में आईआर बेसल या सक्रिय राज्यों एक नया आनुवंशिक मॉडल की तैयारी की आवश्यकता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति आम तौर पर intracellular कम्पार्टमेंट के लिए प्रतिबंधित है ही इसके अलावा, यह आमतौर पर तहखाने झिल्ली प्रोटीन या ऊतक केमोकाइन जमा 7 की तरह छवि बाह्य संरचनाओं के लिए संभव नहीं है. इसके बजाय, कोशिकी एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ अप्रत्यक्ष लेबलिंग वास्तव में किसी भी कोशिका प्रकार या मैट्रिक्स विशिष्ट घटक 8,9 के लिए लचीलापन प्रदान करता है. हालांकि, इस लेबलिंग दृष्टिकोण का बड़ा नुकसान पूरक व्यवस्था पर निर्भर सेल विषाक्तता और कोशिकाओं और बाह्य संरचनाओं 10 के phagocytosis ट्रिगर कर सकते हैं कि प्रतिजन प्रतिरक्षी प्रतिरक्षा परिसरों द्वारा मध्यस्थता immunotoxicity साथ जुड़ा हुआ है.
सूजन या घाव भरने के दौरान बाह्य ट्यूमर microenvironment की मैट्रिक्स, लेकिन यह भी सामान्य ऊतकों की पर्याप्त remodeling आए. ट्यूमर microenvironment की stromal stiffening प्रोमो सकते हैंकारण तनाव प्रेरित संकेतन तंत्र और रक्त और लसीका वाहिकाओं 11 के कारण remodeling के लिए ते ट्यूमर के विकास और आक्रमण. हालांकि, मैट्रिक्स प्रोटीन की लाइव इमेजिंग बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी से पता लगाया जा सकता है कि तंतुमय कोलेजन तक सीमित है. हाल ही में हम imaged कोशिकाओं और ऊतकों संरचनाओं से 5 फोटो और प्रतिरक्षा विषैले नुकसान के जोखिम को कम करता है कि एक उपन्यास intravital इमेजिंग विधि को प्रकाशित किया है. निरंतर intravital दृश्य का एक दौर 2 घंटे 12-17 के लिए 30 मिनट की एक सीमा में है, जहां स्थापित इमेजिंग तकनीक के साथ तुलना में, हमारे intravital immunofluorescence (यदि) तकनीक 12 घंटे (लंबी अवधि 8) इमेजिंग की अनुमति दी. यह इमेजिंग समय हमारे पशु प्रोटोकॉल में परिभाषित सीमाओं की वजह से 12 घंटे तक ही सीमित है, लेकिन यह लंबे समय तक नहीं किया जा सकता कि कोई तकनीकी जवाबी संकेत मिले हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है अगर रक्तचाप और दिल की तरह जानवर के महत्वपूर्ण स्वास्थ्य मानकों,दर 8 नियंत्रित कर रहे हैं. इसके अलावा, एक स्वचालित प्रतिदीप्ति stereomicroscope का उपयोग कर हम एक ही प्रयोग के दौरान कई क्षेत्रों से छवियों को इकट्ठा करने में सक्षम थे और कार्यात्मक रक्त और लसीका वाहिकाओं द्वारा समर्थित त्वचा के शारीरिक संदर्भ में हुई दुर्लभ प्रतिरक्षाविज्ञानी और remodeling प्रक्रियाओं मनाया. Stereomicroscopic लेंस एक अपेक्षाकृत बड़े, 2 सेमी, दूरी काम किया है और दो photon सूक्ष्म प्रकाशिकी के विपरीत पानी विसर्जन vaporizing की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि लंबे समय तक इमेजिंग केवल प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत प्रदर्शन किया गया था. Intravital यदि सामान्य त्वचा के किसी भी बाह्य मैट्रिक्स घटक की प्रतिरक्षा लेबलिंग और पता लगाने की अनुमति दी. इस तकनीक से डिजाइन हानिकारक immunotoxic प्रभाव 5 कारण के बिना जीवित कोशिकाओं और शल्य चिकित्सा द्वारा उजागर माउस डर्मिस पर ऊतक मैट्रिक्स तत्वों के लिए immunostaining का उपयोग करने का अभिनव अवधारणा पर आधारित है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया ही डर्मिस के लिए सुरक्षित हैयह केवल स्वतंत्र रूप से स्वायत्त खून से तंग आ गया और अलग लसीका परिसंचरण द्वारा सूखा, innervated हैं कि कान में दो त्वचा की परतों की जुदाई पर निर्भर करता है के रूप में vasculature. हमारे प्रयोगात्मक स्थापना की अनुमति देता है रक्त और लसीका वाहिकाओं और घाव भरने प्रक्रियाओं के बीच ल्युकोसैट तस्करी सहित कम से कम 12 घंटे, अधिक महत्वपूर्ण patho शारीरिक घटनाओं की एक श्रृंखला के इमेजिंग. मूल प्रकाशन में, हम intravital इमेजिंग के विभिन्न क्षेत्रों में राज्य के अत्याधुनिक मानकों को हमारी तकनीक की तुलना में. नतीजतन, हम प्रारंभिक लसीका वाहिकाओं 15 इकट्ठा करने के बजाय उम्मीद में प्रवेश प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनूठा दृश्य सहित leukocytes के विभिन्न प्रकार, द्वारा रक्त वाहिका परिस्त्राव और लसीका intravasation घटनाओं मनाया. इसके अलावा, अन्य समूहों 9,18 द्वारा किया टिप्पणियों के पूरक, हम विवो CCL21 में एकत्रित पर लेकिन कदा ही प्रारंभिक lymphatics पर मजबूत, टूटनेवाला जमा के रूप में सक्षम है कि पाया.
<p cलड़की = "jove_content"> यहाँ हम एक संशोधित intravital वर्णन दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) का उपयोग तंतुमय कोलेजन के नेटवर्क का पता लगाने के लिए दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जा सकता है कि तकनीक. हम इस विधि को भी वर्तमान इमेजिंग तकनीक 19 से बड़े पैमाने पर बेरोज़गार हैं कि इस तरह के tenascin सी के रूप में मैट्रिक्स अणुओं, जो भी शामिल है गतिशील ट्यूमर microenvironment, के संदर्भ में इमेजिंग कैंसर सेल आक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम ट्यूमर का तंतुमय मैट्रिक्स, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी के साथ पकड़ा, इसके अलावा, हम स्थानीय मैट्रिक्स संकुचन के कारण पोत remodeling के उदाहरण का वर्णन लंबी tenascin सी. से बना नव जमा मैट्रिक्स से ट्यूमर microenvironment के विभिन्न स्थानों पर रह रहे हैं पाया कि ट्यूमर कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली के कोलेजन चतुर्थ साथ ट्यूमर सेल प्रवास के साथ टी सेल बातचीत की अवधि (12 घंटे) इमेजिंग. एक साथ इस तरह के रक्त वाहिनियों पे के रूप में स्थानीय शारीरिक मापदंड, जबकि रिकॉर्डिंग इस तरह की घटनाओं imaged किया जा सकता हैrmeability और लसीका जल निकासी.महत्व
यहाँ हम उच्च संकल्प और तंतुमय के साथ ही जाल की तरह मैट्रिक्स प्रोटीन सहित विभिन्न ऊतक microenvironment घटकों के गतिशील दृश्य की अनुमति देता है कि एक उपन्यास intravital माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. (मैं) intravital प्रतिदीप्ति इमेजिंग खून से या lymphatics में घुला हुआ पदार्थ के रिसाव पर नज़र रखने के लिए, जैसे, microcirculation अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन immunostaining के साथ संयुक्त नहीं किया गया है: यह विधि वर्तमान intravital इमेजिंग तकनीक पर कई फायदे हैं. (Ii) आनुवंशिक रूप से संशोधित संवाददाता चूहों का उपयोग imaged किया जा करने के लिए विशेष प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुमति देता है, लेकिन उनकी उपलब्धता (या नए लोगों को बनाने के लिए पर्याप्त प्रयास) की आवश्यकता है और अध्ययन किया जा सकता है कि सेल प्रकार बातचीत की संख्या की सीमा. (Iii) बाह्य मैट्रिक्स दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी का उपयोग vivo में imaged किया जा सकता है, लेकिन इस तकनीक ही महत्वपूर्ण बाह्य घटकों की एक बड़ी संख्या को छोड़ने, रेशेदार कोलेजन पता लगा सकते हैंतहखाने झिल्ली, fibronectins, tenascins, वृद्धि कारक है, chemokines और वर्तमान अनुसंधान के लिए पहुंच से बाहर ऊतक glycosaminoglycans के रूप में इस तरह के. हमारे विधि इन सीमाओं पर काबू, और मानक इमेजिंग तकनीक विकास कारकों (जैसे VEGF 26) और chemokines (CCL21 5,18 और अंजीर. 2 डी बाध्यकारी अन्य प्रकार की कोशिकाओं, ऊतकों संरचनाओं, हेपरिन सल्फेट की जमा राशि के लिए immunostainings के साथ शामिल है और आगे जोड़ा जा करने की अनुमति देता है ), या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन एक साथ रक्त और / या लसीका प्रवाह ट्रैकिंग करते हुए.
सीमाएं
intravital अगर epifluorescence इमेजिंग मोटी हाइपोडर्मिस (वसा ऊतकों) से वंचित पतली त्वचा फ्लैप, तक ही सीमित है. हम पृष्ठीय कान डर्मिस तकनीक कान डर्मिस तक ही सीमित नहीं है, तो intravital साथ कान त्वचा, epifluorescence की अपेक्षाकृत हानिरहित शल्य प्रदर्शनी के लिए इष्टतम है और संभवतः जैसे को लागू किया जा सकता है पाया जबकिपैर की उंगलियों या नवजात माउस के पीछे त्वचा के संपर्क में त्वचा. Immunofluorescence में रैपिड एंटीबॉडी धुंधला (15 मिनट) यदि निष्क्रिय प्रसार पर निर्भर नहीं है लेकिन कार्यात्मक लसीका जल निकासी और मध्य द्रव प्रवाह की आवश्यकता है, लसीका वाहिकाओं 27 occluded रहे हैं इसलिए कोई धुंधला मनाया जा सकता है. उस के साथ लाइन में, लसीका वाहिकाओं मजबूत तो टपकाया रक्त वाहिका संरचना (घायल वाहिकाओं, arterioles) 5 दाग. पृष्ठीय और उदर कान त्वचा फ्लैप की जुदाई एक हल्के शल्य प्रक्रिया है लेकिन यह विभिन्न ऊतकों की कोशिकाओं के लिए कुछ केशिकाओं और कोशिका मृत्यु के लिए चोट के कारण. एक जैसे सेल अस्तित्व पर दवाओं के हल्के प्रभाव को देख, पूरी तरह से बरकरार ऊतक की जांच करने की जरूरत है जब यह एक समस्या हो सकती है. इसके अलावा phototoxicity और photobleaching से त्वचा की रक्षा करता है कि एंटीऑक्सीडेंट के आवेदन ऊतक oxidative तनाव या नाइट्रिक ऑक्साइड biolog जैसे अध्ययन करने के लिए intravital immunofluorescence तकनीक का उपयोग शामिल नहींवाई.
अंत में, प्रतिरक्षा परिसरों के साथ ऊतक निवासी मैक्रोफेज की चकाचौंध इन कोशिकाओं और ऊतकों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वृक्ष के समान सेल सक्रियण के अध्ययन जैसे प्रभाव को सक्रिय कर सकते हैं.
संशोधन और निवारण
ऊतक oxidative तनाव या नाइट्रिक ऑक्साइड जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए, एस्कॉर्बेट प्रायोगिक उत्पादन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि अन्य ऊतकों संगत मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया गया है. अध्ययन के लक्ष्य समारोह और ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वृक्ष के समान सेल सक्रियण और प्रवास के सक्रियण है कि अगर इसी तरह, चमड़े का प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अवरुद्ध एफसी रिसेप्टर्स से बचा जाना चाहिए. यह (एफ (एबी) 2 एंटीबॉडी टुकड़े) या पता लगाने अभिकर्मकों के रूप में biotinylated एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट streptavidin का उपयोग cleaved एफसी टुकड़ा के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के साथ किया जा सकता है.
भविष्य अनुप्रयोगों
हम एक उपन्यास और अद्वितीय इंट्रा पेशमहत्वपूर्ण अगर दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर स्वयं सहायता समूह का पता चला तंतुमय और परिपक्व कोलेजन के साथ संयोजन में transplantable त्वचा ट्यूमर में बाह्य मैट्रिक्स की छवि गैर तंतुमय घटकों के लिए तकनीक. Epifluorescence इमेजिंग पर बहु – फोटान (या confocal) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के लाभ में से एक Z-stacking संभावना है और में परिणाम बाह्य मैट्रिक्स के भीतर होने वाली घटनाओं के सह स्थानीयकरण स्थानिक, लसीका या रक्त वाहिका, में जैसे ट्यूमर intravasation जो के मामले में मानक epifluorescence माइक्रोस्कोपी ही हमलावर सेल के morphological परिवर्तन से अनुमान लगाया जा सकता है. इस तकनीक को दूर व्यापक क्षमता है. लसीका विशेष photodynamic चिकित्सा 27 से लसीका रोड़ा की व्यवस्था की जांच करने के लिए उदाहरण के लिए यदि हम intravital का इस्तेमाल किया है. इस विधि के अतिरिक्त संभावित अनुप्रयोगों में शामिल हैं लेकिन प्रत्यारोपण अस्वीकृति या रक्त और लसीका के तरीकों की सूजन, तंत्र दौरान त्वचा उन्मुक्ति की जांच तक ही सीमित नहीं रहे tumorigenesis दौरान atic वाहिका विकास.
प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम
एक शारीरिक ऊतक वातावरण बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि सबसे महत्वपूर्ण कदम पृष्ठीय डर्मिस से उदर त्वचा और उपास्थि की एक शल्य चिकित्सा जुदाई है. काटने या प्रमुख धमनी या शिरा occluding उपचार और सेल आंदोलन 8 को सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित करेगा, जो अत्यधिक रक्तस्राव और स्थानीय ऊतक हाइपोक्सिया को बढ़ावा मिलेगा. शल्य गोंद के साथ कान immobilizing ऊतक बेनकाब पर गोंद spilling के रूप में सावधानी से किया जाना चाहिए रक्त वाहिकाओं का रोड़ा द्वारा ऊतकों को एक स्थायी चोट के कारण होगा. माउस का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस और नियंत्रित रखा जाना चाहिए आंखों और फेफड़े ठीक से प्रयोग के दौरान humidified रहना इतना है कि इसके अतिरिक्त, humidified ऑक्सीजन, isoflurane संज्ञाहरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, सोडियम एस्कॉर्बेट हौसले से तैयार रहना चाहिए और अपनी पीएच उपयोग करने से पहले जाँच की.
सारांश में ntent ">, इस intravital immunofluorescence माउस त्वचा में जटिल सेलुलर घटनाओं की आणविक इमेजिंग के साथ शारीरिक समारोह की वास्तविक समय, स्थानीय माप पुल. यह आसानी से के बाद विकास जैसे अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है इसके अलावा, इस पद्धति काफी संभावना है रक्त और लसीका-angiogenesis या अपने लचीलापन और उच्च throughput क्षमता के साथ. विभिन्न रोगजनक एजेंटों द्वारा त्वचा संक्रमण के प्रारंभिक चरणों कल्पना करने के तंत्र, इस intravital तकनीक काफी जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में योगदान कर सकते हैं.The authors have nothing to disclose.
लेखकों इमेज प्रोसेसिंग में मदद के लिए जेरेमी मुख्यमंत्री Teo और एस रयान ओलिवर उनके योगदान के लिए और जोलांटा Kilarska के लिए आभारी हैं. हम दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ समर्थन के लिए EPFL में BIOP कोर सुविधा धन्यवाद
इस काम यूरोपीय अनुसंधान आयोग (डीसी लसीका, 206653-2), यूरोपीय फ्रेमवर्क प्रोजेक्ट 7 (AngioScaff), स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (31-135756), और अमेरिकी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (एनआईएच) / एनआईएच हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI) (RO1 HL096539). इसके अतिरिक्त, रॉबर्ट Wenner पुरस्कार (स्विस कैंसर लीग) से धन खरीद इस अध्ययन में इस्तेमाल Leica stereomicroscope की अनुमति दी. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |