Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes
Summary
We beschrijven hoe de uitvoering fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM)-gebaseerde studies van blaasjes in vaste, gekweekte neuronen. Belangrijke onderdelen van ons protocol etiket voorzien blaasjes met photoconvertible hersenschimmen, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een super-resolutie te produceren.
Abstract
Detectie van fluorescentie vormt de basis voor vele grote schaal gebruikt en snel voortschrijdende microscopie technieken die in de moderne biologische en medische toepassingen. Sterke punten van fluorescentie zijn onder meer de sensitiviteit, specificiteit, en compatibiliteit met live beeldvorming. Helaas, conventionele vormen van fluorescentie microscopie lijden aan een grote zwakte, buigingsbegrensd resolutie in het beeldvlak, die studies van structuren met afmetingen kleiner dan ~ 250 nm belemmert. Onlangs is deze beperking overwonnen door de invoering van superresolutie fluorescentie microscopie technieken, zoals fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM). In tegenstelling tot de conventionele tegenhangers, kan PALM beelden te produceren met een laterale resolutie van tientallen nanometers. Het is nu dus mogelijk om fluorescentie te gebruiken, met zijn talloze krachten, om een spectrum van eerder ontoegankelijke attributen van cellulaire structuur en organisatie helderen.
_content "> Helaas, PALM is niet triviaal te implementeren en succesvolle strategieën vaak moet worden afgestemd op het type systeem onder studie. In dit artikel laten we zien hoe een kleur PALM studies van vesiculaire structuren te implementeren in vaste, gekweekte neuronen. PALM is bij uitstek geschikt om de studie van blaasjes, die dimensies die doorgaans variëren van ~ 50-250 nm. Belangrijke stappen in onze aanpak zijn hebben etikettering neuronen met photoconvertible (groen naar rood) hersenschimmen van blaasje lading, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een hoge-resolutie PALM produceren. we de effectiviteit van onze aanpak aan te tonen ook door de presentatie bijzonder goed opgelost beelden van dense-core blaasjes (DCVS) in gekweekte hippocampale neuronen, die weerleggen de hypothese dat extrasynaptic handel in DCVS grotendeels wordt gemedieerd door DCV clusters.Introduction
Een aantal cellulaire processen afhankelijk nauwkeurige en efficiënte vesikel gemedieerde transport van biomoleculen specifieke subcellulaire bestemmingen. Een prominent voorbeeld is synaptische vergadering, die wordt voorafgegaan door lange varieerden,-blaasje bemiddelde levering van synaptische bestanddelen van sites van biogenese in de neuronale soma om potentieel distale pre-en postsynaptische plaatsen 1.
Fluorescentie microscopie is een krachtige en populaire methode van de bestudering blaasje mensenhandel. Sterke punten van de techniek zijn onder meer de sensitiviteit, specificiteit, en compatibiliteit met live beeldvorming 2. Helaas, tot voor kort, is de techniek te lijden van een grote zwakte, buigingsbegrensd resolutie 2, die studies van structuren met afmetingen kleiner dan ~ 250 nm belemmert. Onlangs, laterale resolutie in fluorescentie microscopie overtroffen de diffractie barrière met de introductie van de super-resolutie fluorescentie microscopy technieken, zoals PALM 3. De laterale resolutie van PALM, tientallen nanometers, is uitermate geschikt voor de studie van blaasjes, die dimensies die doorgaans variëren van ~ 50-250 nm 4 hebben. Het is nu dus mogelijk om fluorescentie te gebruiken, met zijn talloze krachten, om een spectrum van eerder ontoegankelijke attributen van vesicles, waaronder aspecten van de handel naar specifieke subcellulaire locaties helderen.
PALM is niet triviaal te implementeren en succesvolle strategieën vaak moet worden afgestemd op het type systeem onder studie. Hier beschrijven we hoe PALM studies van vesiculaire structuren voeren, en we de doelmatigheid van onze aanpak bij DCVS in hippocampale neuronen. In het bijzonder, maken we gebruik van PALM om de hypothese te staven dat de handel van DCVS om synapsen in de hippocampus neuronen wordt gemedieerd door DCV clusters 5-8.
-Cluster gemedieerde transport van blaasjes aan synapsen in het ontwikkelen van neurons is een intrigerende mogelijkheid, omdat het snelle synaptische stabilisatie en assemblage 9,10 kan vergemakkelijken. Voorstanders van geclusterde handel in DCVS noemen de grote schijnbare grootte van extrasynaptic fluorescerende puncta herbergen exogene DCV lading als bewijs dat clustering 6. Echter, deze puncta verschijnen in beelden geproduceerd met buigingsbegrensde fluorescentiemicroscopie technieken die niet geschikt zijn onderscheidende maat effecten van diffractie van die welke uit clustering.
Om dit probleem op te lossen, hebben we verzameld conventionele groothoek fluorescentie en PALM beelden van de hippocampus neuronen die hersenschimmen gericht op DCVS. Analyse van deze beelden bleek dat> 92% van de vermeende extrasynaptic DCV clusters in conventionele beelden worden opgelost als 80 nm (individuele DCV-en kleinbedrijf) 11 puncta in PALM beelden. Zo, deze gegevens grotendeels vervalt de clustering hypothese zoals toegepast op DCVS in ontwikkelingslanden HippocaMpal neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM en aanverwante super-resolutie fluorescentie microscopie technieken zijn onlangs naar voren gekomen als een waardevolle aanvulling om beter gevestigde vormen van optische microscopie en elektronenmicroscopie (EM) 22-24. Positieve eigenschappen van PALM omvatten relatief eenvoudige monstervoorbereiding en minimale steekproef verstoring. In principe PALM ook worden gebruikt om levende cellen te bestuderen. Waarschijnlijk de belangrijkste negatieve eigenschap van PALM is tijdrovend data-acquisitie, die aanz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent 2 R15 GM061539-02 (aan BAS), 2 R15 NS40425-03 (naar JEL), MH 66.179 (dr. Gary Banker van Oregon Health & Science University / OHSU), en P30 NS061800 (dr. Sue Aicher van OHSU). Wij danken Barbara Smoody voor uitgebreide ondersteuning met de cultuur van hippocampale neuronen, en Drs. Brian Long en James Abney voor een kritische lezing van dit manuscript.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
Riferimenti
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscienze. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
