Super-upplösning avbildning av neurala Tät-core Blåsor
Summary
Vi beskriver hur man ska genomföra photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)-baserade studier av blåsor i anläggningstillgångar, odlade nervceller. Viktiga komponenter i våra protokoll omfattar märknings blåsor med photoconvertible chimärer, samla råbilder glest samplade med en super-upplösning mikroskopi systemet, och bearbetar råbilder för att producera en super-upplösning.
Abstract
Upptäckt av fluorescens är grunden för många allmänt utnyttjade och snabbt framryckande mikroskopi tekniker som används i moderna biologiska och medicinska tillämpningar. Styrkor med fluorescens inkluderar dess känslighet, specificitet, och kompatibilitet med levande bilder. Tyvärr, konventionella former av fluorescensmikroskopi lider av en stor svaghet, diffraktion-begränsad upplösning i bildplanet, vilket försvårar studier av strukturer med dimensioner mindre än ~ 250 nm. Nyligen har denna begränsning övervunnits med införandet av super-upplösning fluorescens mikroskopi tekniker, såsom photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Till skillnad från sina konventionella motsvarigheter, kan PALM producera bilder med en lateral upplösning på tiotals nanometer. Det är alltså nu möjligt att använda fluorescens, med dess otaliga starka sidor, för att belysa ett spektrum av tidigare otillgängliga attribut av cellstruktur och organisation.
_content "> Tyvärr är PALM inte trivialt att genomföra, och framgångsrika strategier ofta måste anpassas till den typ av system som studeras. I den här artikeln visar vi hur man ska genomföra enfärgade PALM studier av vesikulära strukturer i fasta, odlade nervceller. PALM är idealisk för studier av blåsor, som har dimensioner som vanligtvis sträcker sig från ~ 50-250 nm. Viktiga steg i vår strategi ingår att märka nervceller med photoconvertible (grönt till rött) chimärer av vesikler last, samla in råbilder med ett glest samplade super-upplösning mikroskopi systemet, och bearbetning av RAW-bilder för att producera en högupplöst PALM bild. Vi visar också effekten av vår strategi genom att presentera ovanligt väl-upplösta bilder av tät-core vesikler (DCVs) i odlade hippocampus nervceller, vilket motsäger hypotesen att extrasynaptic handel med DCVs förmedlas till stor del av DCV kluster.Introduction
Ett antal cellulära processer är beroende av en noggrann och effektiv vesikel-medierad trafficking av biomolekyler till specifika subcellulära destinationer. Ett framträdande exempel är synaptiska församling, som föregås av långa varierade, vesikler-medierad leverans av synaptiska beståndsdelar från områden med biogenes i neuronala soma till potentiellt distala pre-och postsynaptiska platser 1.
Fluorescensmikroskopi är en kraftfull och populär metod för att studera vesikler människohandel. Styrkor med tekniken inkluderar dess känslighet, specificitet, och kompatibilitet med levande avbildning 2. Tyvärr har fram till relativt nyligen har tekniken led av en stor svaghet, diffraktionsbegränsad upplösning 2, vilket hämmar studier av strukturer med dimensioner mindre än ~ 250 nm. Nyligen, lateral upplösning i fluorescensmikroskopi överträffade diffraktion barriären med införandet av super-upplösning fluorescens milcroscopy tekniker, såsom PALM 3. Den laterala upplösning PALM, tiotal nanometer, är idealisk för studier av blåsor, som har dimensioner som vanligtvis sträcker sig från ~ 50-250 nm 4. Det är alltså nu möjligt att använda fluorescens, med dess otaliga starka sidor, för att belysa ett spektrum av tidigare otillgängliga attribut av blåsor, inklusive vissa aspekter av sin handel till specifika subcellulära webbplatser.
PALM är inte trivialt att genomföra, och framgångsrika strategier ofta måste anpassas till den typ av system som studeras. Här beskriver vi hur man genomför PALM studier av vesikulär strukturer, och vi demonstrera effektiviteten av vår strategi för fallet DCVs i hippocampus nervceller. Framför allt använder vi PALM att ta upp hypotesen att handel med DCVs till synapser i hippocampus nervceller förmedlas av DCV kluster 5-8.
Cluster-medierad handel med blåsor på synapser i utvecklings neurons är en spännande möjlighet för att det kan underlätta en snabb synaptiska stabilisering och montering 9,10. Förespråkare för klustrade handel med DCVs citerar den stora skenbara storleken på extrasynaptic fluorescerande puncta hyser exogen DCV last som bevis för klustring 6. Dessa puncta visas i bilder som genereras med hjälp av diffraktion-begränsad fluorescens mikroskopi tekniker, som inte är anpassade till utmärkstorlekseffekter till följd av diffraktion från de som följer av klustring.
Lös problemet, samlas vi konventionell widefield fluorescens och PALM bilder av hippocampus nervceller som uttrycker chimärer riktade till DCVs. Analys av dessa bilder visade att> 92% av den förmodade extrasynaptic DCV kluster i konventionella bilder löses som 80 nm (individuell DCV stora) 11 puncta i PALM bilder. Således är dessa uppgifter till stor del ogiltig kluster hypotesen som tillämpas på DCVs att utveckla hippocampal neuroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM och tillhörande super-upplösning fluorescens mikroskopi tekniker har nyligen dykt upp som ett värdefullt komplement till mer etablerade former av optisk mikroskopi och elektronmikroskopi (EM) 22-24. Positiva attribut PALM innefattar relativt enkel provberedning och minimal prov störning. I princip är också PALM kan användas för att studera levande celler. Förmodligen den viktigaste negativa attribut av PALM är tidskrävande datainsamling, vilket avsevärt försvårar studier av snabbare dynamis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag 2 R15 GM061539-02 (till BAS), 2 R15 NS40425-03 (till JEL), MH 66179 (till Dr Gary Banker i Oregon Health & Science University / OHSU), och P30 NS061800 (Dr Sue Aicher av OHSU). Vi tackar Barbara Smoody för omfattande stöd med den kultur av hippocampus nervceller, och Dr. Brian Lång och James Abney för en kritisk läsning av detta manuskript.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
Riferimenti
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscienze. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
