طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية
Summary
وتستخدم بروتوكولات المناعية لدراسة توطين بروتين معين في شبكية العين. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم لدراسة ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم.
Abstract
في هذه الورقة وصفنا الأدوات والكواشف، والخطوات العملية اللازمة ل: 1) إعداد الناجح لشبكية العين wholemount لالمناعية و، 2) التصوير الكالسيوم لدراسة الجهد بوابات قنوات الكالسيوم (VGCC) بوساطة إشارات الكالسيوم في شبكية العين خلايا العقدة. أسلوب التصوير الكالسيوم وصفنا القضايا الالتفاف حول تحميل غير محدد من خلايا عديم الاستطالات النازحين في طبقة الخلايا العقدية.
Introduction
خلايا الشبكية العقدة (RGCs) تعبر عن L-، N-، P / Q- وT-نوع VGCC كما هو محدد من خلال الحصار الدوائي من هذه المكونات من خلية كاملة CA القناة الحالية 1،2. VGCC هي بروتينات الغشاء multimeric التي تشارك في إطلاق الإرسال، النسخ الجيني، وتنظيم الخلايا واللدونة متشابك 3،4،5. مصنوعة VGCCs وظيفية من ثلاثة على الأقل فئات متميزة من مفارز: كبيرة، عبر الغشاء α 1 المسام تشكيل مفارز التي تحدد خصائص القناة الفيزيائية الحيوية والدوائية، α مساعد خارج الخلية في المقام الأول 2 δ مفارز وحدات فرعية داخل الخلايا β. وهذا الأخير مجمعين شكل مغايرة التغصن مع مختلف α 1 مفارز وتغير حركية النابضة والاتجار القنوات لغشاء البلازما 6.
على مدى العقود الأخيرة، وقد استخدمت العديد من التقنيات لدراسة البروتين expression، مثل المناعية، انزيم مرتبط المناعي فحص وتحليل الغربي والتدفق الخلوي. هذه التقنيات تتطلب استخدام أجسام مضادة محددة للكشف عن بروتين معين من الفائدة وتوفر أدوات قوية لتوطين وتوزيع بروتينات معينة في الأنسجة المختلفة. التقنيات المستخدمة لكشف وتحديد مستويات مرنا التعبير عن بروتين معين مثل تحليل لطخة الشمالي، RT-PCR، في الوقت الحقيقي الكمي RT-PCR، التهجين في الموقع، ميكروأرس [كدنا] وفحص حماية ريبونوكلياز تقدم نهجا بديلا عندما الأجسام المضادة ليست بسهولة مستويات التعبير المتاحة أو إذا كان من بروتين معين منخفضة 7. ومع ذلك، الحد إلى استخدام مثل هذه التقنيات الجزيئية هو تحديد المطلوب من التسلسل الجيني.
في توطين البروتينات في شبكية العين، المناعية يمكن أن يؤديها على شبكية العين wholemount. نظرا لسهولة الحصول على RGCs، وwholemountإعداد يوفر منصة ممتازة لدراسة توطين بروتينات معينة إلى somata RGC والمحاور الخاصة بهم.
بالإضافة إلى التعريب، وبعض الخصائص الوظيفية للVGCCs في RGCs يمكن البرهنة من خلال استخدام تقنيات التصوير الكالسيوم. نحن تصف بروتوكول التصوير الكالسيوم لتسمية RGCs انتقائي مع صبغة الكالسيوم مؤشر لقياس ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا. مساهمة VGCCs مختلفة للإشارة الكالسيوم في مقصورات الخلوية المختلفة يمكن أن تكون معزولة مع استخدام النوع الفرعي محددة حاصرات قنوات الكالسيوم.
ربما يكون واحدا من أكثر الجوانب المفيدة للتقنية التصوير الكالسيوم الموصوفة هنا هو القدرة على تسجيل في وقت واحد وبشكل مستقل عن RGCs متعددة والمحاور الخاصة بهم. على الرغم من أن العديد من التقنيات الفسيولوجية، مثل خلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك، وتوفير تسجيلات عالية الدقة الزمنية التيارات الغشاء، وجسدية أو مصدر محور عصبي من تساالتيارات البريد المسجل لا يمكن أن يكون هناك تمييز والتسجيلات لا يمكن إلا أن تكون مصنوعة من الخلايا العصبية واحدة في وقت واحد. صفائف Multielectrode (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) قادرة على تسجيل المسامير وقت واحد من العديد من الخلايا، ولكن يمكن أن لا يكشف ولا تميز تفعيل، على سبيل المثال، أنواع فرعية مختلفة من قنوات الكالسيوم. مياس تسجيل تفضيلي من الخلايا التي تقع على مقربة من قطب معين 8 و سجل من الخلايا التي تولد طفرات كبيرة 9. توفر أساليب التصوير الضوئي استراتيجية بديلة لتمكين التسجيلات في وقت واحد ومستقلة للسكان كامل من الخلايا التي يمكن أن تكون متكاملة مع المعلومات التي تم الحصول عليها من مسرى مكروي خلية واحدة والتصحيح تسجيل المشبك وتسجيل MEA. على الرغم من أن تقنيات التصوير الكالسيوم الموصوفة هنا كانوا يعملون لدراسة ديناميات الكالسيوم من RGCs، المشبك التصحيح والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكن أن تستخدم أيضا بشكل متواز لزيادة توضيح التيارات الأيونية وارتفاعه خصائص RGCs.
<pالطبقة = "jove_content"> منذ خلايا عديم الاستطالات المشردين يشكلون حوالي 60٪ من السكان الخلايا العصبية في طبقة الخلايا العقدية في الشبكية الماوس 10، كان هدفنا لاستخدام تقنية تحميل أن تصف بشكل انتقائي RGCs مع صبغة مؤشر الكالسيوم الاصطناعية في إعداد wholemount. على الرغم من الأصباغ الاصطناعية مؤشر الكالسيوم توفر منصة ممتازة لدراسة ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا، وقد أعاق استخدام على نطاق واسع من عدم القدرة على تحميل فعال مجموعات سكانية محددة من الخلايا العصبية ضمن شبكة معينة. وقد أجريت العديد من التقنيات مثل معظم العملية 11 و electroporation 8،12 لتحميل جميع السكان من الخلايا، لكن هذه التقنيات لا تميز بين أنواع معينة من الخلايا. المشفرة وراثيا توفر مؤشرات الكالسيوم القدرة على تسمية انتقائي فئات معينة من السكان من الخلايا، لكن هذه الأساليب تتطلب جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 13. تصف تقنية لدينا methoد انتقائي لتسمية RGCs في إعداد wholemount عبر العصب البصري جدعة حقن صبغة مؤشر الكالسيوم.أخذت معا، والتقنيات الهيكلية والفسيولوجية الموضحة في هذه المقالة توفر منبرا لدراسة توطين ومساهمة VGCCs إلى إشارة الكالسيوم في RGCs والمحاور الخاصة بهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، التي وصفناها اثنين من تقنيات مختلفة: 1) المناعية لإظهار فلوو-4 التوطين إلى خلايا العقدة في wholemounts الشبكية، و 2) التصوير الكالسيوم لتحليل ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم.
المناعية باست…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور S. ستيلا وهيلين فونج للمساهمات في بروتوكول التصوير الكالسيوم. نشكر صفائح الدكتور ك لتصوير مشاهد المقابلة. نشكر الدكتور أرلين هيرانو لتعليقاتها على المخطوطة. وأجري هذا المشروع البحث والتطوير من قبل المؤلفين في كلية ديفيد جيفن للطب في جامعة كاليفورنيا ويتم بفضل اتفاق العقد الذي منحت ويديرها البحوث الطبية وقيادة العتاد في الجيش الأميركي (USAMRMC) والتطبيب عن بعد والتكنولوجيا المتقدمة مركز الأبحاث (TATRC)، في فورت ديتريك بولاية ميريلاند تحت رقم العقد: W81XWH-10-2-0077. كما جاء الدعم لهذه الدراسات من المعاهد الوطنية للصحة EY04067 وVA الاستحقاق مراجعة (ملحوظة). الأهلي هو VA الوظيفي عالم أبحاث.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
Riferimenti
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
- Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
- Berridge, M. J., et al. Calcium–a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
- Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
- Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
- Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
- Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
- Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
- Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
- Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
- Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
- Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
- Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
- Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
- Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
- Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
- Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
- Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
- Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
- Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
- Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
- Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
- Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
