Immunhistokjemi protokoller brukes for å studere lokalisering av et bestemt protein i retina. Kalsium imaging teknikker er ansatt for å studere kalsium dynamikk i netthinnens ganglion celler og deres aksoner.
I denne artikkelen beskriver vi verktøy, reagenser, og de praktiske tiltak som er nødvendig for: 1) vellykket utarbeidelse av wholemount netthinne for immunhistokjemi og, 2) kalsium bildebehandling for studiet av spenning gated kalsium kanal (VGCC) mediert kalsium signalisering i retinal ganglion-celler. Den kalsium avbildningsmetode vi beskrive omgår spørsmål om uspesifikk lasting av ford amacrine celler i ganglion celle laget.
I retina-gangliecellene (RGCs) uttrykke L, N, P / Q-og T-type VGCC som bestemt ved farmakologisk blokkade av disse Komponentene av hele cellen Ca-kanalstrøm 1,2. VGCC er transmembrane multimere proteiner som er involvert i senderen utgivelsen, gentranskripsjon, celleregulering og synaptisk plastisitet 3,4,5. Funksjonelle VGCCs består av minst tre forskjellige klasser av subenheter: store, trans α en pore forming subenheter som etablerer kanalens biofysiske og farmakologiske egenskaper, først og fremst ekstracellulære hjelpe α 2 δ subenheter og intracellulære β subenheter. De to sistnevnte skjema heteromeric komplekser med forskjellige α en subenheter og endre gating kinetikk og trafficking av kanalene til plasmamembranen seks.
Over de siste tiårene har mange teknikker blitt ansatt for å studere protein EXPREssion, slik som immunhistokjemi, enzym-bundet immunosorbent assay, western analyse og strømningscytometri. Disse teknikkene krever bruk av spesifikke antistoffer for detektering av et gitt protein av interesse, og gir kraftige verktøy for lokalisering og fordeling av spesifikke proteiner i forskjellige vev. Teknikker som brukes til å påvise og kvantifisere mRNA-ekspresjonsnivåene av et bestemt protein slik som Northern blot analyse, RT-PCR, sanntids kvantitativ RT-PCR, in situ hybridisering, cDNA mikromatriser og ribonuklease beskyttelsestest gir en alternativ tilnærming når antistoffer er ikke lett tilgjengelig, eller hvis uttrykk nivåer av et bestemt protein er lave 7. Imidlertid er en begrensning på bruken av slike molekylære teknikker er den nødvendige identifisering av gensekvensen.
Å lokalisere proteiner i netthinnen, kan immunhistokjemi utføres på wholemount netthinne. På grunn av tilgjengeligheten av RGCs, den wholemountpreparatet gir en utmerket plattform for å studere lokalisering av spesifikke proteiner til RGC somata og deres aksoner.
I tillegg til deres lokalisering, kan enkelte funksjonelle egenskaper hos de VGCCs i RGCs demonstreres gjennom bruk av kalsium-avbildningsteknikker. Vi beskriver en kalsium bildebehandling protokoll for å selektivt merke RGCs med en kalsium indikator fargestoff å måle intracellulære kalsium dynamikk. Bidraget av forskjellige VGCCs til kalsium-signalet i forskjellige cellulære avdelinger kan isoleres ved bruk av subtype-spesifikke Ca-kanalblokkere.
Kanskje et av de mest fordelaktige aspekter av kalsium avbildningsteknikk som er beskrevet her er evnen til samtidig og uavhengig av hverandre opp fra flere RGCs og deres axoner. Selv om mange fysiologiske teknikker, for eksempel hele cellen patch clamp opptak, gi høy tidsoppløsning innspillinger av membran strømninger, det somatiske eller aksonal kilde these strømninger innspilte kan ikke bli diskriminert og opptak kan kun gjøres fra en enkelt nervecelle gangen. Multielectrode arrays (MEAS) er i stand til samtidig opptak av pigger fra mange celler, men kan heller ikke detektere eller diskriminere aktivering av, for eksempel, forskjellige subtyper av kalsiumkanaler. MEAS fortrinnsvis ta opp fra celler som er plassert i umiddelbar nærhet til en gitt elektrode 8 og ta opp fra celler som genererer store pigger ni. Optiske avbildningsmetoder gi en alternativ strategi for å aktivere samtidige og uavhengige opptak av hele populasjoner av celler som kan integreres med informasjon innhentet fra én celle microelectrode og patch clamp opptak og MEA opptak. Selv om kalsium-avbildningsteknikker som er beskrevet her ble anvendt for å studere de kalsium dynamikken i RGCs, kan patch clamp og MEAs også brukes i parallell for ytterligere å belyse de ioniske strømninger og tilsetnings egenskaper RGCs.
<pclass = "jove_content"> Siden ford amacrine celler utgjør ca 60% av nevronale befolkningen i ganglion celle laget i musen retina 10, målet vårt var å bruke en laste teknikk som selektivt etiketter RGCs med en syntetisk kalsium indikator fargestoff i en wholemount forberedelse. Selv om syntetiske kalsium indikatorfargestoffer gir en utmerket plattform for studiet av den intracellulære kalsiumdynamikk, har sin utbredt bruk blitt hindret av manglende evne til å effektivt laste spesifikke populasjoner av nerveceller innenfor et gitt nettverk. Mange teknikker som bulklaste 11 og elektroporering 8,12 er blitt utført for å laste hele grupper av celler, men slike teknikker ikke diskriminerer mellom spesifikke celletyper. Genetisk kodede kalsium indikatorer gir evnen til selektivt å merke spesifikke populasjoner av celler, men slike metoder krever generering av transgene dyr 13. Vår teknikk beskriver en method for selektivt å merke RGCs i wholemount preparat via synsnervestump injeksjon av en kalsiumindikator fargestoff.Tatt sammen, de strukturelle og fysiologiske teknikker beskrevet i denne artikkelen gi en plattform for å studere lokalisering og bidrag av VGCCs til kalsium signal i RGCs og deres aksoner.
I denne artikkelen har vi beskrevet to ulike teknikker: 1) Immunhistokjemi å vise Fluo-4 lokalisering til ganglion celler i netthinnens wholemounts, og 2) Kalsium bildebehandling å analysere kalsium dynamikk i netthinnens ganglion celler og deres aksoner.
Immunhistokjemi hjelp wholemounts har blitt brukt til å avsløre lokalisering av proteiner i gnager retina 20-23. Det er imidlertid noen begrensninger. Kvaliteten av fargings er sterkt avhengig av evnen til antistoffet til å …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. S. Stella og Helen Vuong for bidrag til kalsium bildebehandling protokollen. Vi takker Dr. K. blad for filming intervju scener. Vi takker Dr. Arlene Hirano for hennes kommentarer til manuskriptet. Dette FoU-prosjekt ble gjennomført av forfatterne ved David Geffen School of Medicine ved UCLA og er gjort mulig av en kontrakt avtale som ble tildelt og administreres av US Army Medical Research & forsyningskommando (USAMRMC) og telemedisin & Advanced Technology Research Center (TATRC), ved Fort Detrick, MD under kontrakt Antall: W81XWH-10-2-0077. Støtte for disse studiene også kom fra NIH EY04067 og en VA Merit omtale (NB). NCB er en VA Career Forsker.
Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |