Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina
Summary
Imunohistoquímica protocolos são usados para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.
Abstract
Neste artigo descrevemos as ferramentas, os reagentes e os passos práticos que são necessários para: 1) preparação bem-sucedida de retinas wholemount para imunohistoquímica e, 2) imagens de cálcio para o estudo da tensão fechado de canais de cálcio (VGCC) mediada sinalização de cálcio na retina células ganglionares. O método de imagem de cálcio que descrevem problemas contorna relativas à carga não-específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares.
Introduction
As células ganglionares da retina (RGCs) expressar L, N, P / Q e T-tipo VGCC como determinado por meio do bloqueio farmacológico desses componentes de toda a célula actual canal Ca 1,2. VGCC são proteínas transmembrana multim�icos que estão envolvidos na liberação do transmissor, a transcrição do gene, regulação celular e sináptica 3,4,5 plasticidade. VGCCs funcionais são compostos de pelo menos três classes distintas de subunidades: grandes, transmembrana α 1 poro formando subunidades que estabelecem propriedades biofísicas e farmacológicas do canal, principalmente extracelular α auxiliar 2 δ subunidades e subunidades β intracelulares. Os dois últimos formam complexos heterom�icas com diferentes α um subunidades e alterar a cinética de propagação e tráfico de canais para a membrana plasmática 6.
Nas últimas décadas, várias técnicas têm sido empregadas para estudar expre proteínassion, tais como imuno-histoquímica, ligada ensaio imunoenzimático, análise de Western e citometria de fluxo. Estas técnicas requerem a utilização de anticorpos específicos para a detecção de uma determinada proteína de interesse e fornecem ferramentas poderosas para a localização e distribuição de proteínas específicas em diferentes tecidos. As técnicas usadas para detectar e quantificar níveis de uma proteína particular de expressão de ARNm, tais como a análise de manchas de Northern, RT-PCR, em tempo real quantitativa de RT-PCR, hibridação in situ, de microarrays e ensaio de protecção de ribonuclease proporcionam uma abordagem alternativa, quando os anticorpos não são prontamente os níveis de expressão ou se disponíveis de uma proteína particular são baixos 7. No entanto, uma limitação para a utilização de tais técnicas moleculares é necessária a identificação da sequência do gene.
Para localizar as proteínas na retina, imuno-histoquímica pode ser realizada em retinas wholemount. Devido à acessibilidade das CGR, a wholemountpreparação fornece uma plataforma excelente para o estudo da localização de proteínas específicas para o RGC somata e seus axónios.
Em adição à sua localização, algumas propriedades funcionais dos VGCCs em CGRs pode ser demonstrada através da utilização de técnicas de imagiologia de cálcio. Descreve-se um protocolo de imagens de cálcio para etiquetar selectivamente CGR com um corante indicador de cálcio para medir a dinâmica de cálcio intracelulares. A contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio em diferentes compartimentos celulares podem ser isoladas com o uso de bloqueadores dos canais de Ca específicos do subtipo.
Talvez um dos aspectos mais benéficos da técnica de imagiologia de cálcio descritos aqui é a capacidade de gravar, simultaneamente e de forma independente a partir de múltiplas CGR e seus axónios. Embora muitas técnicas fisiológicas, como a correção de células gravação braçadeira todo, proporcionar gravações de alta resolução temporal das correntes de membrana, o somático ou fonte axonal de these correntes gravados não podem ser discriminados e gravações só pode ser feita a partir de um único neurónio de cada vez. Matrizes multieletrodo (AMA) são capazes de gravar simultaneamente picos de muitas células, mas podem detectar e nem discriminar a ativação de, por exemplo, diferentes subtipos de canais de cálcio. Meas preferencialmente gravar a partir de células que estão localizadas na proximidade de um determinado eletrodo 8 e gravar a partir de células que geram grandes picos de 9. Métodos de imagem Optical fornecer uma estratégia alternativa para permitir que as gravações simultâneas e independentes de populações inteiras de células que podem ser integrados com as informações obtidas a partir de uma única célula de microeletrodos e remendo gravação de fixação e gravação de MEA. Embora tenham sido empregues as técnicas de imagiologia de cálcio descritos aqui para estudar a dinâmica de cálcio de CGRs, sujeição do emplastro e AAM também podem ser utilizados em paralelo para elucidar as correntes iónicas e propriedades spiking de CGRs.
<pclass = "jove_content"> Como as células amácrinas deslocadas compõem cerca de 60% da população dos neurônios da camada de células ganglionares da retina do rato 10, o nosso objetivo era usar uma técnica de carga que rotula seletivamente CGR com um corante indicador de cálcio sintético em um preparação wholemount. Embora corantes indicadoras de cálcio sintéticos fornecem uma excelente plataforma para o estudo da dinâmica de cálcio intracelular, a sua utilização generalizada tem sido dificultado pela incapacidade para carregar de forma eficaz as populações específicas de neurónios no interior de uma determinada rede. Muitas técnicas, tais como volume de carga 11 e eletroporação 8,12 foram realizados para carregar populações inteiras de células, no entanto, essas técnicas não discriminar entre tipos específicos de células. Geneticamente codificado indicadores de cálcio fornecem a capacidade para identificar selectivamente populações específicas de células, no entanto, estes métodos requerem a geração de animais transgénicos 13. Nossa técnica descreve uma metod etiquetar seletivamente CGR na preparação wholemount via óptica injeção coto do nervo de um corante indicador de cálcio.Tomadas em conjunto, as técnicas estruturais e fisiológicas descritas neste artigo fornecer uma plataforma para o estudo da localização e da contribuição dos VGCCs para o sinal de cálcio no CGR e seus axônios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, descrevemos duas técnicas diferentes: 1) Imunohistoquímica para mostrar Fluo-4 de localização para as células ganglionares da retina em wholemounts, e 2) Imagem de cálcio para analisar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios.
A imuno-histoquímica utilizando wholemounts foi usado para revelar a localização de proteínas no roedor retina 20-23. No entanto, existem algumas limitações. A qualidade da coloração depende muito …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. S. Stella e Helen Vuong para contribuições para o protocolo de imagem de cálcio. Agradecemos Sheets Dr. K. para filmar as cenas de entrevista. Agradecemos ao Dr. Arlene Hirano por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto de pesquisa e desenvolvimento foi realizado pelos autores na Geffen de Medicina David na UCLA e é possível graças a um acordo de contrato que foi concedido e administrado pela Research & Material Médico Comando do Exército dos EUA (USAMRMC) ea Telemedicina e Tecnologia Avançada Centro de Pesquisa (TATRC), em Fort Detrick, Maryland sob Número do Contrato: W81XWH-10-2-0077. O suporte para esses estudos também vieram NIH EY04067 e uma revisão Mérito VA (NB). BCN é uma VA Carreira de Investigação Scientist.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
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