Articolo metodologico
Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.
In questo documento si descrivono gli strumenti, reagenti, e le misure pratiche che sono necessarie per: 1) preparazione di successo di retine wholemount per immunoistochimica e, 2) Calcio Imaging per lo studio di tensione gated canali del calcio (VGCC) mediata segnalazione di calcio in retina cellule gangliari. Il metodo di imaging del calcio descriviamo questioni aggira in materia di non-specifico carico di cellule amacrine sfollati nello strato di cellule gangliari.
Cellule gangliari retiniche (RGC) esprimono L, N-, P / Q e T-tipo VGCC come determinato attraverso il blocco farmacologico di queste componenti della cellula intera Ca canale corrente 1,2. VGCC sono proteine transmembrana multimerici che sono coinvolte nel rilascio del trasmettitore, la trascrizione del gene, regolazione cellulare e sinaptica plasticità 3,4,5. VGCCs funzionali sono costituiti da almeno tre classi distinte di subunità: grandi, transmembrana α 1 formano pori subunità che stabiliscono proprietà biofisiche e farmacologiche del canale, α ausiliario principalmente extracellulare 2 subunità δ e subunità β intrac....
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Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere degli animali da esperimento emesse dalla politica US Public Health Service on Human Care e uso di animali da laboratorio e la University of California-Los Angeles (UCLA) comitato per la ricerca degli animali. Sono stati utilizzati Maschio e femmina adulto ratti Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) tra l'età di 3-5 settimane.
1. animali e tessuti Preparazione Wholemount Retina e Immunoistochimica protocollo
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Immunomarcatura con anticorpi specifici fornisce una piattaforma per studiare la localizzazione di particolari proteine di interesse nella retina e la tecnica di imaging calcio permette lo studio del contributo dei VGCCs verso le dinamiche di calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.
Utilizzando un anticorpo contro le RBPMS proteine delle cellule gangliari (RNA binding protein con splicing multipla) che identifica selettivamente RGCs 19, siamo stati in grado .......
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In questo articolo, abbiamo descritto due diverse tecniche: 1) L'immunoistochimica per mostrare Fluo-4 localizzazione delle cellule gangliari della retina in wholemounts, e 2) Calcio Imaging per analizzare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.
Immunoistochimica utilizzando wholemounts è stato utilizzato per rivelare la localizzazione delle proteine nei roditori retina 20-23. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni. La qualità della coloraz.......
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Gli autori non hanno informativa.
Ringraziamo il Dr. S. Stella e Helen Vuong per contributi al protocollo di imaging del calcio. Ringraziamo Fogli Dr. K. per girare le scene di intervista. Ringraziamo il Dr. Arlene Hirano per i suoi commenti sul manoscritto. Questo progetto di ricerca e sviluppo è stata condotta da presso la David Geffen School of Medicine presso la UCLA autori ed è reso possibile da un accordo di contratto che è stato assegnato e gestito dal Medical Research e Materiel Command dell'Esercito degli Stati Uniti (USAMRMC) e la Telemedicina & Advanced Technology Research Center (TATRC), a Fort Detrick, nel Maryland sotto Numero del contratto: W81XWH-10-2-0077. Il supporto per questi ....
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Forbici diritte | WPI | 14124-G | Strumenti di dissezione |
| Pinze diritte | WPI | 501985 | Strumenti di dissezione |
| Forbici a iride curve | WPI | Strumenti | di dissezione |
| WPI Carta da filtro in cellulosa | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mezzi di montaggio per fluorescenza |
| Fluo-4 pentapotassio | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurano | Abbott Laboratories | 05260-05 | anestesia |
| Vetrino per microscopio | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscopio | Zeiss | ||
| Axioplan 40X (NA 0.8) obiettivo lente | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Capra Anti-coniglio IgG (H+L) Anticorpo | Sonde molecolari | A-11034 | Anticorpo secondario |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | Un anticorpo policlonale di coniglio è stato generato contro l'N-terminale del RBPMS polipeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, da un venditore commerciale (ProSci, Poway, CA). |
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