Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina
Summary
Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.
Abstract
En este trabajo se describen las herramientas, los reactivos y las medidas prácticas que se necesitan para: 1) preparación exitosa de retinas wholemount para inmunohistoquímica y, 2) imágenes de calcio para el estudio de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC) mediada por la señalización de calcio en la retina células ganglionares. El método de imagen de calcio describimos elude cuestiones relativas a la carga no específico de células amacrinas desplazadas en la capa de células ganglionares.
Introduction
Las células ganglionares de la retina (CGR) expresan L, N, P / Q y de tipo T VGCC como se determina a través del bloqueo farmacológico de estos componentes de la célula entera Ca canal actual 1,2. VGCC son proteínas multiméricas transmembrana que están implicados en la liberación del transmisor, la transcripción de genes, la regulación celular y 3,4,5 plasticidad sináptica. VGCCs funcionales se componen de al menos tres clases distintas de subunidades: grandes, transmembrana α 1 formador de poros subunidades que establecen propiedades biofísicas y farmacológicas del canal, principalmente extracelular auxiliar α 2 δ subunidades y las subunidades β intracelulares. Los dos últimos complejos heteroméricos forma con diferentes subunidades α 1 y alterar la cinética de activación periódica y el tráfico de los canales a la membrana plasmática 6.
En las últimas décadas, muchas técnicas se han empleado para estudiar la proteína expresión, como la inmunohistoquímica, ensayo inmunoenzimático, el análisis occidental y citometría de flujo. Estas técnicas requieren el uso de anticuerpos específicos para la detección de una proteína dada de interés y proporcionan potentes herramientas para la localización y distribución de proteínas específicas en diferentes tejidos. Las técnicas utilizadas para detectar y cuantificar los niveles de expresión de ARNm de una proteína en particular, como el norte de blot, RT-PCR en tiempo real cuantitativa RT-PCR, hibridación in situ, microarrays de ADNc y ensayo de protección de ribonucleasa proporcionan un enfoque alternativo cuando los anticuerpos no son fácilmente los niveles de expresión disponible o si de una proteína particular son bajos 7. Sin embargo, una limitación al uso de tales técnicas moleculares es la identificación requerido de la secuencia del gen.
Para localizar proteínas en la retina, inmunohistoquímica se puede realizar en retinas wholemount. Debido a la accesibilidad de la CGR, la wholemountpreparación proporciona una excelente plataforma para el estudio de la localización de las proteínas específicas del somata RGC y sus axones.
Además de su localización, algunas propiedades funcionales de los VGCCs en CGR se pueden demostrar mediante el uso de técnicas de imagen de calcio. Se describe un protocolo de imágenes de calcio para etiquetar selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio para medir la dinámica del calcio intracelular. La contribución de las diferentes VGCCs a la señal de calcio en diferentes compartimentos celulares se puede aislar con el uso de bloqueadores de los canales de Ca subtipo específico.
Quizás uno de los aspectos más beneficiosos de la técnica de imagen de calcio descrito aquí es la capacidad de grabar simultáneamente y de forma independiente a partir de múltiples CGR y sus axones. Aunque muchas técnicas fisiológicas, como la grabación de patch clamp de célula entera, proporcionan altos grabaciones resolución temporal de las corrientes de membrana, la somática o fuente axonal de thescorrientes e grabados no pueden ser discriminados y grabaciones sólo se pueden hacer de una sola neurona a la vez. Arrays multielectrodo (AAM) son capaces de registrar simultáneamente picos de muchas células, pero tampoco pueden detectar ni discriminar la activación de, por ejemplo, los diferentes subtipos de canales de calcio. Meas preferentemente grabar a partir de células que se encuentran en las proximidades de un electrodo 8 y registro de las células que generan grandes picos 9. Métodos de imagen ópticos proporcionan una estrategia alternativa para que las grabaciones simultáneas e independientes de toda la población de células que se pueden integrar con la información obtenida a partir de una sola célula de microelectrodos y grabación de patch clamp y grabación MEA. Aunque se emplearon las técnicas de imagen de calcio descritos aquí para estudiar la dinámica de calcio de CGR, patch clamp y AAM también se pueden utilizar en paralelo a aclarar aún más las corrientes iónicas y propiedades enriquecidas de CGR.
<pclass = "jove_content"> Dado que las células amacrinas desplazadas constituyen aproximadamente el 60% de la población neuronal en la capa de células ganglionares de la retina en el ratón 10, nuestro objetivo era utilizar una técnica de carga que etiqueta selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio sintético en una preparación wholemount. Aunque colorantes indicadores de calcio sintéticos proporcionan una excelente plataforma para el estudio de la dinámica de calcio intracelular, su uso generalizado se ha visto obstaculizado por la incapacidad para cargar eficazmente poblaciones específicas de neuronas dentro de una red dada. Se han realizado muchas técnicas, tales como carga a granel 11 y 8,12 electroporación para cargar poblaciones enteras de células, sin embargo, estas técnicas no discriminan entre tipos de células específicos. Genéticamente codificados indicadores de calcio proporcionan la capacidad de etiquetar selectivamente poblaciones específicas de células, sin embargo, tales métodos requieren la generación de animales transgénicos 13. Nuestra técnica describe un method etiquetar selectivamente CGR en la preparación wholemount vía óptica inyección muñón del nervio de un colorante indicador de calcio.En conjunto, las técnicas estructurales y fisiológicos descritos en este artículo proporcionan una plataforma para estudiar la localización y la contribución de los VGCCs a la señal de calcio en la CGR y sus axones.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, hemos descrito dos técnicas diferentes: 1) La inmunohistoquímica para mostrar Fluo-4 a la localización de las células ganglionares de la retina en wholemounts, y 2) El calcio de imágenes para analizar la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.
La inmunohistoquímica utilizando wholemounts se ha usado para revelar la localización de las proteínas en el roedor retina 20-23. Sin embargo, hay algunas limitaciones. La calida…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. S. Stella y Helen Vuong de contribuciones para el protocolo de imágenes de calcio. Agradecemos Hojas Dr. K. para el rodaje de las escenas de la entrevista. Agradecemos al Dr. Arlene Hirano por sus comentarios sobre el manuscrito. Este proyecto de investigación y desarrollo se llevó a cabo por los autores en la Escuela David Geffen de Medicina en UCLA y es posible gracias a un acuerdo de contrato que se adjudicó y administrado por el Comando de Investigación y Material Médico del Ejército de EE.UU. (USAMRMC) y la tecnología de la telemedicina y Avanzado Centro de Investigación (TATRC), en Fort Detrick, MD con el Número de Contrato: W81XWH-10-2-0077. El apoyo a estos estudios también provino de NIH EY04067 y opiniones de Mérito VA (NB). BCN es un VA Carrera del Investigador Científico.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
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