Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri
Summary
İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.
Abstract
Bu yazıda araçları, reaktifler ve için gerekli olan pratik adımları açıklar: imünohistokimya için Wholemount retina 1) başarılı bir hazırlık ve retinal kalsiyum sinyalini aracılı voltaj kapılı kalsiyum kanalı (VGCC) çalışmasında 2) kalsiyum görüntüleme ganglion hücrelerinin. Kalsiyum görüntüleme yöntemi biz ganglion hücre tabakası yerinden amacrine hücreleri olmayan spesifik yükü ile ilgili alt ettiği durumlar açıklanmaktadır.
Introduction
1,2 akım kanalı Ca tam hücrenin, bu bileşenlerin farmakolojik blokajı yoluyla belirlendiği gibi, retinal ganglion hücrelerinin (RGCs) L, N, P / Q-ve T-tipi VGCC ifade eder. VGCC verici sürümü, gen transkripsiyonu, hücre düzenleme ve sinaptik plastisite 3,4,5 katılan transmembran Multimerik proteinlerdir. 1 gözenek ve kanal biyo-fiziksel ve farmakolojik özellikler, esas olarak, hücre dışı yardımcı α 2 δ alt birimleri ve hücre içi β alt birimi tespit alt birimleri oluşturan α büyük, zar: Fonksiyonel VGCCs alt ünitelerinin en az üç farklı sınıflardan oluşur. Farklı α 1 alt birimleri ile son iki şekilde heteromerik kompleksleri ve plazma membranı 6 kanalların yolluk kinetik ve kaçakçılığı değiştirebilir.
Son on yılda, birçok teknik protein Expre incelemek için istihdam edilmiştirBu İmmünohistokimya, enzime bağlı immünosorbent deneyi batı analizi ve akış sitometresi olarak salgılanması. Bu teknikler, ilgi konusu bir proteinin tespit edilmesi için spesifik antikorların kullanılmasını gerektirir ve farklı dokular içindeki yerine ve özel proteinlerin dağıtılması için güçlü bir araç sağlar. Antikorları kolayca olmadığında bu tür kuzey leke analizi gibi özel bir proteinin mRNA ifade seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılan teknikler, RT-PCR, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR, in situ hibridizasyon, cDNA mikrodizileri ve ribonükleaz koruma deneyi için alternatif bir yaklaşım sağlar özel bir proteinin ya da eğer mevcut ekspresyon seviyeleri 7 düşüktür. Ancak, bu tür moleküler teknikler kullanılarak bir sınırlama gen dizisinin gerekli tanımlanmasıdır.
Retinada proteinleri lokalize etmek için immünohistokimya wholemount retina üzerinde gerçekleştirilebilir. RGCs erişilebilirlik, wholemount nedeniyleHazırlık RGC somata ve akson özel proteinlerin yerelleştirme incelemek için mükemmel bir platform sağlar.
Bulundukları bölgeye ek olarak, RGCs VGCCs bazı fonksiyonel özellikleri kalsiyum görüntüleme teknikleri kullanılarak ispat edilebilir. Biz seçici hücre içi kalsiyum dinamiklerini ölçmek için bir kalsiyum gösterge boya ile RGCs etiketlemek için bir kalsiyum görüntüleme protokol açıklar. Çeşitli hücre bölmesi içinde bulunan kalsiyum sinyaline farklı VGCCs katkısı alt tiplerine spesifik Ca kanal blokerlerinin kullanımı ile izole edilebilir.
Belki burada tarif kalsiyum görüntüleme tekniğinin en yararlı yönlerinden biri aynı anda ve birbirinden bağımsız birden fazla RGCs ve aksonlarından kaydetmek için yeteneğidir. Bu Tam hücre yama kenetleme kayıt gibi bir çok fizyolojik teknikleri, yüksek zamansal çözünürlüğü membran akımların kayıtları, somatik veya thes aksonal kaynağı sağlamak rağmenKaydedilen E akımları ayrımcılık olamaz ve kayıtları bir seferde sadece tek bir nöron yapılabilir. Multielectrode diziler (ölçüm) eş zamanlı olarak bir kısım hücrelerde ani kaydetme özelliğine sahiptir, fakat tespit veya aktivasyonunu ayırt, kalsiyum kanallarının, örneğin, farklı alt tipler kaldırılmaz. Tercihen büyük sivri 9 oluşturmak hücrelerinden belirli bir elektrot 8 ve kaydetmek için yakın bir yerde bulunduğu bir hücre kayıt ölç. Optik görüntüleme yöntemleri, tek hücreli mikro elektrot ve yama kelepçe kayıt ve MEA kayıt elde edilen bilgilerin entegre edilebilir hücrelerin bütün popülasyonlarının eşzamanlı ve bağımsız kayıtları etkinleştirmek için alternatif bir strateji sağlamak. Burada açıklanan kalsiyum görüntüleme teknikleri RGCs kalsiyum dinamiklerinin incelenmesi için kullanılmıştır, ancak, yama kelepçe ve ÇÇA daha da iyonik akımları ve RGCs spike özelliklerini açıklamak için paralel olarak kullanılabilir.
<psınıf = "jove_content"> yerinden amacrine hücreleri 10 retina farede ganglion hücre tabakasında nöronal nüfusun yaklaşık% 60'ını oluşturan bizim amacımız isteğe bağlı olarak bir sentetik kalsiyum endikatör boyası ile RGCs etiketler bir yükleme yapmak için teknik wholemount hazırlanması. Sentetik kalsiyum göstergesi boyalar hücre içi kalsiyum dinamikleri çalışma için mükemmel bir platform sağlar rağmen, yaygın kullanımı etkili belirli bir ağ içinde nöronların belirli popülasyonlarının yüklemek için yetersizlik tarafından engellenmiştir. Bu tür dökme yükleme 11 ve elektroporasyon gibi birçok teknik 8,12 hücre popülasyonları bütün Bununla birlikte, bu tür teknikler, özel hücre tipleri arasında ayrım yapamaz ve yüklemek için yapılmıştır. Genetik olarak kalsiyum göstergeler seçici hücrelerinin spesifik popülasyonlarının etiket olanağı sağlar kodlanmış Bununla birlikte, bu yöntemler, transgenik hayvanların 13 üretilmesini gerektirir. Bizim teknik bir yöntemii açıklard seçici bir kalsiyum gösterge boyasının optik sinir güdük enjeksiyon yoluyla Wholemount hazırlanmasında RGCs etiketlemek için.Birlikte ele alındığında, bu makalede özetlenen yapısal ve fizyolojik teknikleri RGCs ve akson olarak lokalizasyonu ve kalsiyum sinyali VGCCs katkısını incelemek için bir platform sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
1) İmmünhistokimya retina wholemounts içinde ganglion hücrelerine Flu-4 yerelleştirme göstermek için, ve 2) Kalsiyum görüntüleme retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamikleri analiz etmek: Bu makalede, iki farklı teknikler tarif var.
Wholemounts kullanılarak immünohistokimya 20-23 retina kemirgen proteinlerin lokalizasyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Ancak, birkaç sınırlamalar vardır. Boyanma kalitesi, ilgili antijen ve il…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kalsiyum görüntüleme protokole katkılarından dolayı Dr S. Stella ve Helen Vuong teşekkür ederiz. Biz röportaj sahneleri filme Dr K. Sheets teşekkür ederim. Biz el yazması onu yorumlar için Dr Arlene Hirano teşekkür ederim. Bu araştırma ve geliştirme projesi Teletıp ve İleri Teknoloji UCLA Tıp, David Geffen School yazarlar tarafından yürütülen ve US Army Medical Research & Levazım Komutanlığı (USAMRMC) tarafından verilen ve uygulanan bir sözleşme anlaşması ile mümkün yapılır ve Sözleşme Numarası altında MD Fort Detrick'te Araştırma Merkezi (TATRC),: W81XWH-10-2-0077. Bu çalışmalar için destek de NIH EY04067 ve VA Merit Şu (NB) geldi. NCB Bir VA Kariyer Araştırmacı olduğunu.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
Riferimenti
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
- Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
- Berridge, M. J., et al. Calcium–a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
- Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
- Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
- Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
- Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
- Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
- Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
- Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
- Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
- Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
- Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
- Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
- Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
- Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
- Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
- Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
- Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
- Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
- Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
- Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
- Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
