四分体启用条码序列(BEST)取代分离,破坏和间距四分体的手动流程。的最优隔离四分体通过荧光激活细胞分选到琼脂平板上,通过搅拌与玻璃珠分离出孢子,并确定哪个随机排列菌落,从同一原始四分使用分子条形码而得。
四分体分析是酵母遗传学一个有价值的工具,但这个过程的繁琐的人工性质已阻碍了其应用在大尺度上。条码启用四分体测序(BEST)1代替隔离,破坏和间距四分体的手动流程。凭借一个孢子形成特异的GFP融合蛋白,其允许四分体的荧光激活细胞分选,直接到琼脂平板上,其中所述子囊被酶消化和孢子被打乱,并随机由玻璃珠电镀排列的最优隔离四分体。单倍体克隆,然后分配妹妹孢子的关系, 即有关哪些孢子起源于同一个四分体,利用基因分型中读取分子条形码。通过去除手工剥离的瓶颈,数百四分甚至上千可被分离以分钟计。在这里,我们提出了以表现最佳的酵母所需的实验步骤的详细说明酿酒酵母 ,首先通过从单倍体减数分裂后代衍生的菌落隔离杂合二倍体菌株。
减数分裂基因作图,俗称四分体分析,是中央的酵母遗传学。简单地说,双单倍体品系,每个包含每个染色体的一个副本,交配形成二倍体杂株式两份每个染色体,分别来自父母。氮饥饿二倍体细胞诱导减数分裂(孢子),其中染色体复制,进行重排,并分为四个单倍体细胞(孢子或分离子)与等位基因分别来自父母的新组合。从单一减数分裂产生四个孢子可以通过一个手动过程,称为四分体解剖分离。
这是自原始出版物已经改变相对较少,1937年4传统的四分体解剖2,3,有三个目标。首先,已经历减数分裂(四分体)细胞必须从营养细胞的背景分离。在传统的分析,这是通过一个研究者谁完成的,使用显微镜,在视觉上识别在琼脂平板上四分体和采用了微操作装置可视地识别四分体琼脂平板上,并用显微操作器的四分体移动到所述板的无细胞区域。接着,4个孢子在四分体必须物理分离,以防止interspore交配。四分体中的孢子通过既是子囊,原二倍体细胞的细胞壁的残余,以及一组interspore桥5固定在一起。在传统的四分体分析子囊被酶消化去除,研究员使用显微操纵器,打破interspore桥梁和捉弄除了孢子。最后,个人孢子被排列在该保持孢子之间的关系的网格图案, 也就是说 ,所有的子代在一排四个是相同的原四分体的妹妹孢子。一位经验丰富的酵母研究者可以完成解剖10四分体(一种普遍接受的最低数目的过程每个交叉)中约15分钟。
我们已经开发了一种新的高通量基因分型四分体的方法,我们称之为乙arcodeÉ对 T etrads nabled S equencing(BEST)1。通过使大量的后代是孤立的,基因分型,并保持在一个方式,允许所有四个减数分裂产物的妹妹孢子关系到恢复个体的产生和基因分型的最优扩展了现有方法中的高通量基因。这是通过使用三种主要的策略( 图1)来完成的。首先是引进一名记者构造,标签已经历减数分裂与GFP细胞,并允许他们通过荧光激活细胞分选(FACS)来分离。第二是一个高度复杂的DNA条形码的形式掺入(共15个随机核苷酸的字符串)被发送到所有4个孢子四分体中,并且可以通过重组Progen公司的DNA测序阅读y和从而识别来自同一四分妹妹孢子。三是基因分型的步骤,最好就是与众多的基因分型平台,捕捉这两个一组的基因组标记以及四分体特异的条形码兼容。我们采用了限制性位点相关的DNA标记的测序(RAD-SEQ)6的方法,指示基因组测序,以特定的限制性位点1,由此捕获的子代菌株的基因组中的一个一致的2-3%,以及该质粒携带的条形码。四分体的关系以及从十字架的经验源性基因分型数据恢复允许丢失的信息,包括与低覆盖的序列标记的状态和不能存活(因此不可恢复)个人的基因型完全准确的推断。在这里,我们描述了在最常用的微生物为减数分裂映射,酵母S.方法的应用酵母 , 但与机体特定意图的次要取代男装,融合到GFP,例如不同的孢子特异性蛋白,该方法应该是很容易移植到其他微生物,包括微生物,其中减数分裂映射显著更加劳动密集的或当前棘手。
图1的最优方法(A)的pCL2_BC质粒是2微米质粒与孢子形成特异的GFP融合,对G418的抗性,和一个15聚体随机条形码。质粒文库的构建在Ludlow 等[1]中描述。 ( 二)条形码质粒的池改造成从跨二倍体菌株。 ( 三)转化,然后生长在选择和〜10,000转化的菌落汇集和孢子。在减数分裂的四分孢子各继承一个共同PY印有条码的质粒。 ( 四)四联球菌是从unsporulated细胞用流式细胞仪分离和收集琼脂平板上,在那里他们被消化和破坏,使每个孢子形成一个殖民地。 (E)的菌落,然后挑入96孔板中,表型和基因分型。在基因分型质粒条形码读取和用于识别每个四分体的四名成员。这个数字已经被修改勒德洛等[1]。 请点击此处查看该图的放大版本。
遗传学研究的许多领域,从复杂性状的映射11到相关DNA重组12机制的研究,需要极其大量的后代和高量的DNA测序。那嫁给高通量DNA测序的能力传统方法的电力技术有可能使这在以前是顽固性的研究。尽管一些高通量酵母遗传学方法已经有效地具体问题得到了应用,每个都有功亏一篑传统的四分体分析的广泛适用性的限制。通过采用高通量的方法相结合的四分体解剖和基因分型酵母杂交的后代最佳解决了这些挑战。在复用RAD标签测序相结合,提供了最好的一种廉价的方式来收集信息,基因型为每个子代菌株,同时保持四分体的关系由独特的四分体条形码手段。0;所有目前使用的高通量方法,最佳最密切概括了手动解剖酵母交所提供的信息。
最好的有两个主要特点。首先是使用流式细胞仪的迅速隔离四分远离unsporulated细胞培养(协议第5-6步)。隔离数以千计的荧光事件(四分体)的能力,为最佳的吞吐量其最大的收益。这种自动化提供了手动清扫十字架与产孢低效率的更大的优势,因为需要直观地识别罕见事件的时间增加。第二个关键特征是使用一种高度复杂的分子条形码(协议步骤2)被发送到一个四分体的每个姊妹孢子。因为这些条形码可以用来计算重建已随机分布在琼脂平板上,需要手动阵列单元中的有序栅格缓解孢子之间的四分体的关系。最后,因为分子条形码和孢子形成特异的GFP报告基因是物理连接的(在相同的质粒),只是保留了分子条形码四分体是通过FACS分选选中。
有两个方面的考虑支配的时间的文化应该在产孢培养基中培养的长度。首先,由于特定的孢子记者(SPS2-GFP)在减数分裂早期表达,绿色荧光蛋白本身并不能从尚未完成减数分裂( 即二分体)细胞区分完整的4孢子四分体。而另外的流式细胞仪门可能会降低荧光,不完整的四分体的数量,以减少这些不必要的事件最简单的方法是简单地监视孢子培养(步骤3.3),一旦新的四分体已经停止继续形成。在我们的实验中,二价基排序的频率小于1%。其次,在室温中度过产孢培养基中,不加搅拌一些十字架额外的时间(步骤3.4)SIGnificantly提高了四分体由玻璃珠电镀过程中的分离((协议第6步),事实上,这个步骤是用于一些杂交的破坏绝对必要的。
像所有的高通量方法,最佳比相应的传统方法“喧闹”。在适度调低最佳的效率比传统的四分体解剖,可能会导致从几个因素的组合。一个因素是,否则活孢子的损失增加,这可能是由于该过程的机械应力扩散或增加孢子死亡期间导致粘附到玻璃珠。减数分裂过程中的第二个因素可能是简单的质粒丢失。第三个因素可能是一种有效的减少从混合基因型的菌落产生可用的殖民地,在我们的飞行员殖民地的估计〜5%,跨越1。它很可能是这些殖民地代表妹妹孢子分离的故障。因为快速氟escence排序和孢子分离允许四分的巨大数字的集合,最好的是装备精良,以克服在减少这种规模效益。而最佳的未来的迭代可以提高效率接近于人工清扫,这或许是更可能是DNA测序能力目前指数的轨迹将迅速弥补可用应变损失的这个水平。无论如何,进行四分体分析到最佳可应用于规模的能力,使研究,目前不可行通过手动的方法。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国立卫生研究院的/ NHGRI基因组学者/教师转型奖(K22 HG002908)给AMD与系统生物学研究所和卢森堡大学之间的战略伙伴关系的支持。请求菌株或质粒,应直接向阿蜜杜德利(aimee.dudley @ gmail.com)。
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |