Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung auf Agarplatten, trennt die Sporen durch Schütteln mit Glasperlen, und bestimmt, welche zufällig angeordnet Kolonien wurden aus der gleichen ursprünglichen Tetrade mit Molekular Barcodes abgeleitet.
Tetrad Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für Hefe-Genetik, aber die aufwändige manuelle Art des Verfahrens hat seine Anwendung auf großen Skalen behindert. Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) 1 ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden aufgrund einer Sporenspezifische GFP-Fusionsprotein, das Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Tetraden ermöglicht direkt auf Agar-Platten, wo der Ascus enzymatisch verdaut, und die Sporen zerstört werden und zufällig durch Glasperlenbeschichtung angeordnet. Die haploiden Kolonien werden dann Schwester Sporen Beziehungen zugeordnet, also Informationen darüber, welche Sporen stammten aus der gleichen tetrad, mit molekular Barcodes während Genotypisierung lesen. Durch das Entfernen der Flaschenhals der manuellen Zerlegung, können Hunderte oder sogar Tausende von Tetraden in Minuten isoliert werden. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung der erforderlich ist, um BEST in der Hefe durchzuführen experimentellen VerfahrenSaccharomyces cerevisiae, die mit einem heterozygoten diploiden Stamm durch die Isolierung von Kolonien aus der haploiden Nachkommen meiotischen abgeleitet.
Meiotische Gen-Kartierung, die gemeinhin als Tetradenanalyse bekannt, ist von zentraler Bedeutung für Hefe-Genetik. Kurz gesagt, werden zwei haploiden Stämme, die jeweils eine einzelne Kopie jedes Chromosoms enthalten, zusammengefügt, um einen heterozygot diploide Stamm mit zwei Kopien von jedem Chromosom, eine von jedem Elternteil zu bilden. Hungernde diploiden Zellen für Stickstoff induziert Meiose (Sporenbildung), in dem Chromosomen duplizieren, Umlagerung, und teilen sich in vier haploide Zellen (Sporen oder Abkömmlinge) mit neuen Kombinationen von Allelen von jedem Elternteil. Die vier Sporen aus einer Meiose ergeben, können durch einen manuellen Prozess namens tetrad Dissektion isoliert werden.
Konventionelle tetrad Dissektion 2,3, die relativ wenig seit der ursprünglichen Veröffentlichung im Jahr 1937 4 geändert hat, hat drei Ziele. Zunächst müssen Zellen, die Meiose (Tetraden) unterzogen wurden, von einem Hintergrund von vegetativen Zellen isoliert werden. Bei herkömmlichen Analyse, wird dies durch einen Forscher, der erreicht, mitein Mikroskop visuell identifiziert Tetraden auf einer Agar-Platte und beschäftigt ein Mikromanipulator Gerät visuell identifizieren Tetraden auf einer Agar-Platte und mit einem Mikromanipulator, um die Tetrade auf einem zellfreien Bereich der Platte zu bewegen. Weiter müssen die vier Sporen in der Tetrade physikalisch getrennt werden, um interspore Stecken. Sporen innerhalb einer Tetrade werden sowohl von einem Ascus, der Rest der Zellwand des ursprünglichen diploiden Zelle, und eine Reihe von Brücken interspore 5 zusammengehalten werden. Bei herkömmlichen Tetradenanalyse die Ascus durch enzymatische Verdauung entfernt und ein Forscher nutzt die Mikromanipulator, um die interspore Brücken brechen auseinander und necken die Sporen. Schließlich werden die einzelnen Sporen in einem Gittermuster, das die Beziehung zwischen der Sporen unterhält angeordnet sind, dh alle Nachkommen in einer Reihe von vier Schwester Sporen des gleichen ursprünglichen Tetrade. Ein erfahrener Hefe-Forscher können den Prozess der Zerlegung 10 Tetraden (eine allgemein akzeptierte Mindestzahl vervollständigenpro Quer) in ca. 15 min.
Wir haben einen neuen Hochdurchsatz-Genotypisierung tetrad Methode, die wir als B arcode E Enabled S equencing von T etrads (BEST) 1 entwickelt. BEST baut auf aktuellen Methoden in der Hochdurchsatz-Genetik, indem du die Generierung und Genotypisierung einer großen Zahl von Nachkommen, die isoliert sind, Genotyp, und als Individuen in einer Weise, die Schwester Sporen Beziehungen aller vier meiotischen Produkte gewonnen werden können gehalten werden. Dies wird unter Verwendung von drei Hauptstrategien (Fig. 1) erreicht. Zuerst ist die Einführung eines Reporterkonstrukt, das Zellen, die mit GFP Meiose durchlaufen haben Etiketten und ermöglicht es ihnen, durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Zweitens ist der Einbau eines hochkomplexen DNA Barcode (eine Kette von 15 zufälligen Nukleotiden) in einer Form, die an allen vier Sporen einer Tetrade übertragen wird und durch DNA-Sequenzierung des rekombinanten PROGEN leseny und damit identifiziert Schwester Sporen aus der gleichen Tetrade. Drittens ist die Genotypisierung Schritt, und am besten mit zahlreichen Plattformen, die Genotypisierung Capture sowohl eine Reihe von genomischer Marker sowie die Tetrade spezifische Barcode-kompatibel ist. Wir beschäftigen eine Restriktions-assoziierten DNA-Tag-Sequenzierung (RAD-Seq) 6 Methode, die Genom-Sequenzierung, um spezifische Restriktionsstellen 1 leitet, wodurch eine konsistente 2-3% des Genoms von Nachkommen der Stämme sowie die Erfassung der plasmidgetragenen Barcode . Die Erholung der Tetrade Beziehungen zusammen mit der empirisch abgeleiteten Genotypisierung Daten aus der Quer ermöglicht die genaue Rückschlüsse auf fehlende Informationen, einschließlich des Status von Markern mit geringer Sequenzabdeckung und das komplette Erbgut von nicht lebensfähig (und damit nicht behebbarer) Individuen. Hier beschreiben wir die Anwendung des Verfahrens in dem am häufigsten verwendeten Mikroorganismus für meiotischen Zuordnung der Hefe S. cerevisiae. jedoch mit geringfügigen Substitutionen von Organismus-spezifischen GrundHerren, z. B. verschiedene Sporulation-spezifische Proteine mit GFP fusioniert ist, sollte das Verfahren ohne weiteres übertragbar auf andere Mikroorganismen, einschließlich Organismen, in denen meiotischen Zuordnung ist wesentlich arbeitsintensiv oder momentan unlösbar sein.
Abbildung 1. BEST-Methode. (A) Die pCL2_BC Plasmid ist ein 2-Mikron-Plasmid mit einer Sporenbildung spezifische GFP-Fusions, Resistenz gegen G418, und ein 15-mer Zufalls Barcode. Der Bau der Plasmid-Bibliothek wird in Ludlow et al 1 beschrieben. (B) Ein Pool von Barcode-Plasmide in die diploide Stamm aus einer Kreuzung umgewandelt. (C) Die Transformanten werden dann zur Auswahl gezüchtet und ~ 10.000 transformierten Kolonien werden vereinigt und mit Sporen. Während der Meiose jeweils Sporen einer Tetrade erbt eine Zusammenarbeitpy der Barcode-Plasmid. (D) Tetrads aus unsporulated Zellen durch FACS getrennt und auf Agar-Platten, wo sie verdaut werden und gestört, dass die einzelnen Sporen, um eine Kolonie zu bilden gesammelt. (E) Die Kolonien werden dann nahm in 96-Well-Platten, phänotypisiert und genotypisiert. Während Genotypisierung das Plasmid Barcode gelesen und verwendet werden, um die vier Mitglieder jeder Tetrade identifizieren. Diese Zahl hat sich von Ludlow et al 1 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Viele Bereiche der Genetik Forschung, die von komplexen Abbildungsmerkmal 11 auf die Untersuchung der Mechanismen 12 zugrunde liegenden DNA-Rekombination, erfordern eine extrem große Anzahl von Nachkommen und große Mengen von DNA-Sequenzierung. Techniken, die die Leistung von herkömmlichen Ansätzen mit der Kapazität von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung zu heiraten haben das Potenzial, Studien, die vorher unlösbar waren zu ermöglichen. Obwohl mehrere Hochdurchsatz-Methoden haben Hefegenetik tatsächlich auf spezifische Probleme angewendet hat jede Einschränkungen, die kurz von der breiten Anwendbarkeit der konventionellen Tetradenanalyse fallen. BEST-Adressen diese Herausforderungen durch den Einsatz einer Hochdurchsatz-Ansatz, der Tetrade Dissektion und Genotypisierung des Nachkommen von Hefe-Kreuze. In Verbindung mit Multiplex-RAD-Tag-Sequenzierung, bietet BEST eine kostengünstige Möglichkeit, Genotyp Informationen für jeden Nachkommen Stamm aufzulesen Wahrung tetrad Beziehungen durch einzigartige tetrad Barcodes.0; Von allen derzeit verwendeten Hochdurchsatzverfahren, am nächsten BEST rekapituliert die Informationen durch eine manuell zerlegt Hefe Kreuz zur Verfügung gestellt.
BEST hat zwei wichtige Funktionen. Die erste ist die Verwendung von FACS, um schnell zu isolieren unsporulated Tetraden von Zellen in der Kultur (Protokoll Schritte 5-6). Die Möglichkeit, Tausende von fluoreszierenden Ereignisse (Tetraden) zu isolieren gibt BEST größten Gewinn an Durchsatz. Diese Automatisierung bietet einen noch größeren Vorteil gegenüber der manuellen Zerlegung für Kreuze mit geringer Sporenbildung Effizienz, aufgrund der erhöhten Zeit, um visuell zu identifizieren seltene Ereignisse benötigt. Die zweite wichtige Merkmal ist die Verwendung eines hoch komplexen molekularen Barcode (Protokoll Schritt 2), die für jede Schwester Sporen einer Tetrade übertragen wird. Da diese Barcodes verwendet werden, um rechnerisch zu rekonstruieren, die Tetrade Beziehungen zwischen Sporen, die zufällig auf einer Agarplatte verteilt wurden, die Notwendigkeit, manuell Arrayzellen in einem geordneten Raster gelindert werden. Schließlichda das Molekular Barcode und die Sporenbildung spezifischen GFP-Reporter-Gen physikalisch (auf dem gleichen Plasmid) verbunden werden nur Tetraden, die die molekulare Barcode beibehalten wurden durch FACS-Sortierung ausgewählt.
Es gibt zwei Aspekte, die Länge der Zeit, die Kulturen sollte in der Sporulation Medium inkubiert werden, zu regeln. Erstens, weil die Sporenbildung spezifische Reporter (SPS2-GFP) früh in der Meiose ausgedrückt, allein GFP unterscheidet nicht komplett 4-Sporen Tetraden aus Zellen, die noch nicht abgeschlossen haben Meiose (dh Dyaden). Während zusätzliche FACS-Gating kann die Zahl der fluoreszierenden, unvollständige Tetraden zu verringern, ist der einfachste Weg, um diese unerwünschten Ereignisse verringern einfache Überwachung des Sporenkultur (Schritt 3.3) und fort einmal neue Tetraden haben aufgehört zu bilden. In unseren Experimenten ist die Frequenz der Dyaden sortiert weniger als 1%. Zweitens, für einige Kreuze zusätzliche Zeit in Sporulationsmedium verbrachte bei RT ohne Rühren (Schritt 3.4) significantly verbessert die Trennung von Tetraden, die von den Glasperlen während des Plattierens ((Protokoll Schritt 6). In der Tat ist dieser Schritt für die Unterbrechung einiger Kreuzungen unbedingt erforderlich.
Wie alle Hochdurchsatz-Methoden ist BEST "lauter" als die entsprechenden konventionellen Ansatz. Die leichte Reduktion der Effizienz der BEST Vergleich zu herkömmlichen tetrad Dissektion konnte aus Kombinationen von verschiedenen Faktoren führen. Ein Faktor ist der erhöhte Verlust an sich lebensfähiger Sporen, die von Haftung an den Glasperlen während des Streuens oder erhöhte Sporen Tod aufgrund der mechanischen Beanspruchungen des Prozesses führen kann. Ein zweiter Faktor könnte einfach Plasmid-Verlust während der Meiose werden. Ein dritter Faktor könnte eine wirksame Abnahme der nutzbaren Kolonien aus Kolonien mit gemischten Genotypen ergeb sein, Kreuze schätzungsweise ca. 5% der Kolonien in unserer Pilot ein. Es ist wahrscheinlich, dass diese Kolonien repräsentieren Ausfälle von Schwester Sporentrennung. Da die schnelle Fluorescence Sortier-und Sporen Trennung erlauben die Sammlung von riesigen Mengen von Tetraden wird BEST gut gerüstet, um Rückgänge in Effizienz auf dieser Skala zu überwinden. Während künftige Iterationen des BEST könnten Wirkungsgrade, die der von manuellen Präparation zu erhöhen, ist es vielleicht eher, dass die aktuelle Flugbahn des exponentiellen DNA-Sequenzierung Kapazität schnell zu kompensieren für diese Ebene der nutzbaren Stamm Verlust. Unabhängig davon, wird die Fähigkeit, Tetradenanalyse auf die Waage, um die am besten angewendet werden kann, führen Studien zu ermöglichen, die derzeit nicht machbar durch manuelle Methoden sind.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch ein NIH / NHGRI Genome Scholar / Fakultät Transition Award (K22 HG002908), um AMD und eine strategische Partnerschaft zwischen dem Institut für Systembiologie und der Universität Luxemburg unterstützt. Anträge für die Stämme oder Plasmide sollte Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com) gerichtet werden.
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |