Barcode Enabled Sekvensering av Tetrads (BEST) erstatter manuelle prosesser for å isolere, forstyrre og avstands tetrads. BEST isolerer tetrads av fluorescens-aktivert celle sortering på agar plater, skiller sporene etter agitasjon med glassperler, og bestemmer hvilke tilfeldig kledd kolonier ble avledet fra samme opprinnelige tetrad ved hjelp av molekylære strekkoder.
Tetrad analyse er et verdifullt verktøy for gjær genetikk, men arbeidskrevende manuell innholdet i prosessen har hindret sin søknad på store skalaer. Barcode Enabled Sekvensering av Tetrads (BEST) en erstatter manuelle prosesser for å isolere, forstyrre og avstands tetrads. Best isolerer tetrads i kraft av en sporulering spesifikk GFP fusjonsprotein som muliggjør fluorescens-aktivert cellesortering tetrads direkte på agarplater, der ascus enzymatisk fordøyd og sporene er avbrutt og tilfeldig kledd med glassperler plating. De haploide koloniene blir deretter tildelt søsterspore relasjoner, det vil si informasjon om hvilke sporer stammer fra samme tetrad, ved hjelp av molekylære strekkoder lest under genotyping. Ved å fjerne flaskehalsen for manuell disseksjon, kan hundrevis eller kanskje tusenvis av tetrads bli isolert i løpet av minutter. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av de eksperimentelle prosedyrer som kreves for å utføre BEST i gjærSaccharomyces cerevisiae, og starter med et heterozygot diploid stamme ved isolering av koloniene avledet fra haploid meiotisk avkom.
Meiotisk genet kartlegging, vanligvis kjent som tetrad analyse, står sentralt i gjær genetikk. Kort fortalt, er to haploide stammer, som hver inneholder en enkeltkopi av hvert kromosom, paret for å danne et heterozygot diploid stamme med to kopier av hvert kromosom, en fra hver av foreldrene. Sulter diploide celler for nitrogen induserer meiose (sporulation) hvor kromosomer duplisere, gjennomgår omorganisering, og dele inn i fire haploide celler (sporer eller segregants) med nye kombinasjoner av alleler fra hver av foreldrene. De fire sporene som følge av en enkelt meiose kan isoleres ved en manuell prosess som kalles tetrad disseksjon.
Konvensjonell tetrad disseksjon 2,3 som har endret seg relativt lite siden den opprinnelige utgivelsen i 1937 fire, har tre mål. For det første må celler som har gjennomgått meiose (tetrads) isoleres fra en bakgrunn av vegetative celler. Ved konvensjonell analyse, oppnås dette ved en forsker som, ved hjelpet mikroskop, identifiserer visuelt tetrads på en agar plate, og benytter en mikromanipulator apparat visuelt identifisere tetrads på en agar plate, og ved hjelp av en mikromanipulator for å bevege tetrad på en celle-frie område av platen. Deretter må de fire sporene i tetrad separeres fysisk å forhindre interspore parring. Sporene i en tetrad blir holdt sammen av både en ascus, som er blitt igjen i celleveggen av den opprinnelige diploid celle, og et sett med interspore broer 5. I konvensjonell tetrad analyse ascus fjernes ved enzymatisk fordøyelse, og en forsker bruker mikromanipluatoren å bryte interspore broer og erte hverandre sporene. Til slutt blir de individuelle sporer oppstilt i et gittermønster som opprettholder forholdet mellom sporene, det vil si alt avkom på en rad av fire er søster sporer av samme original tetrad. En erfaren gjær forsker kan fullføre prosessen med å dissekere 10 tetrads (en allment akseptert minimum antallper kryss) i ca 15 min.
Vi har utviklet en ny high-throughput tetrad genotyping metode, som vi kaller B ARCODE E nabled S equencing av T etrads (BEST) en. BEST utvider på dagens metoder i high-throughput genetikk ved å muliggjøre produksjon og genotyping av et stort antall avkom som er isolert, genotypet, og vedlikeholdes som individer på en måte som gjør at søsterspore relasjoner av alle fire meiotisk produkter som skal gjenvinnes. Dette oppnås ved bruk av tre hovedstrategier (figur 1). Først er innføring av en reporter konstruksjon som etiketter celler som har gjennomgått meiose med GFP og tillater dem å bli isolert ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). For det andre er inkorporering av en meget kompleks DNA strekkode (en streng av 15 tilfeldige nukleotidene) i en form som blir overført til alle fire sporer av en tetrad, og kan leses av DNA-sekvensering av det rekombinante Progeny og dermed identifiserer søstersporer fra samme tetrad. For det tredje er den genotyping trinn, og det beste er kompatible med en rekke genotyping plattformer som fanger opp både et sett av genomiske markører samt tetrad spesifikke strekkode. Vi benytter et restriksjonssete-assosierte DNA-sekvense tag (RAD-seq) 6 Fremgangsmåte som dirigerer genom sekvense til spesifikke restriksjonsseter 1, for derved å fange en konsistent 2-3% av genomet av avkom-stammer, så vel som plasmid-båret strekkode . Utvinningen av tetrad forbindelser sammen med empirisk avledet genotyping data fra korset tillater nøyaktig slutning av manglende informasjonen, inkludert status for markører med lav sekvens dekning og den komplette genotypen til inviable (og derfor uopprettelig) individer. Her beskriver vi anvendelse av fremgangsmåten på den mest brukte mikroorganisme for meiotisk kartlegging, gjæren S. cerevisiae. Men med mindre erstatninger av organismen spesifikke reagents, for eksempel ulike sporulation spesifikke proteiner smeltet til GFP, skal metoden være lett overførbar til andre mikroorganismer, inkludert organismer der meiotisk kartlegging er betydelig mer arbeidskrevende eller nåværende problematiske.
Figur 1. Beste metoden. (A) pCL2_BC plasmid er en 2-mikron-plasmidet med en sporulering spesifikk GFP fusjon, motstand mot G418, og en 15-mer tilfeldig strekkode. Bygging av plasmidet biblioteket er beskrevet i Ludlow et al en. (B) En pool av strekkode plasmider er forvandlet til den diploide belastningen fra et kryss. (C) Transformanter blir så dyrket på utvalget og ~ 10 000 transformerte kolonier blir slått sammen og sporulated. Under meiose hver spore av en tetrad arver en copy av strekkodet plasmid. (D) Tetrads separeres fra unsporulated celler ved FACS og samlet på agar-plater, hvor de blir fordøyd og forstyrret for å tillate hver spore for å danne en koloni. (E) Kolonier blir så plukket inn i 96-brønners plater, phenotyped og genotypet. Under genotype plasmidet strekkode leses og brukes til å identifisere de fire medlemmene i hver tetrad. Dette tallet har blitt forandret fra Ludlow et al en. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mange områder av genetisk forskning, som strekker seg fra kompleks egenskap mapping 11 for å studere mekanismene bak DNA-rekombinasjon 12, krever et svært høyt antall avkom og store volumer av DNA-sekvensering. Teknikker som gifter seg med kraften i konvensjonelle tilnærminger med kapasiteten på høy gjennomstrømming DNA-sekvensering har potensial til å muliggjøre studier som tidligere var problematiske. Selv om flere high-throughput gjær genetikk metoder har blitt brukt effektivt til spesifikke problemer, har hver begrensninger som faller kort av bred anvendelse av konvensjonell tetrad analyse. BESTE adresser disse utfordringene ved å ansette en høy gjennomstrømming tilnærming som kombinerer tetrad disseksjon og genotype avkom av gjær kors. I forbindelse med multiplexed RAD-tag sekvensering, tilbyr BEST en billig måte å fange opp genotype informasjon for hver avkom belastning samtidig bevare tetrad relasjoner ved hjelp av unike tetrad strekkoder.0; Av alle i dag brukes store gjennomgangs metoder, tettest sammenfatter BEST informasjonen som gis av en manuelt dissekert gjær kryss.
BEST har to viktige funksjoner. Den første er ved bruk av FACS for å raskt isolere tetrads bort fra unsporulated celler i kultur (Protocol trinn 5-6). Muligheten til å isolere tusenvis av fluorescerende hendelser (tetrads) gir BEST sin største gevinst i gjennomstrømningen. Dette automatisering gir en enda større fordel i forhold til manuell disseksjon for krysninger med lav sporulering effektivitet, på grunn av den økte tiden som er nødvendig for visuelt å identifisere sjeldne hendelser. Den andre viktig trekk er bruken av en meget kompleks molekyl strekkode (Protocol Trinn 2), som blir overført til hver søster spore av en tetrad. Fordi disse strekkodene kan bli brukt til å rekonstruere de beregningsmessig tetrad forhold mellom sporene som er tilfeldig fordelt over en agar plate, behovet for manuell matrisecellene i et ordnet gitteret er unødvendig. Endeligfordi den molekylære strekkode og sporulering spesifikke GFP reporter-genet er fysisk koblet (på det samme plasmid), blir bare tetrads som har beholdt den molekylære strekkode valgt av FACS-sortering.
Det er to hensyn som styrer hvor lang tid at kulturer skal inkuberes i sporulation medium. Først, fordi sporulering spesifikk rapportør (SPS2-GFP) er uttrykt tidlig meiose, GFP alene skiller ikke komp 4-spore tetrads fra celler som ikke har fullført meiose (dvs. dyads). Mens ekstra FACS gating kan redusere antall fluorescerende, ufullstendige tetrads, er den enkleste måten å redusere disse uønskede hendelser rett og slett overvåke sporulation kultur (Step 3,3) og fortsetter gang nye tetrads har sluttet å danne. I våre eksperimenter, er frekvensen av dyads sortert mindre enn 1%. For det andre, for noen kors ekstra tidsbruk i sporulation medium ved RT uten agitasjon (Step 3,4) significantly forbedrer separasjonen av tetrads av glassperlene under pletter ((Protocol trinn 6). Faktisk er absolutt nødvendig for at forstyrrelse av noen krysser dette trinnet.
Som alle store gjennomgangs metoder, er BEST "støy" enn tilsvarende konvensjonelle tilnærming. Den beskjeden reduksjon i effektivitet av BEST sammenlignet med konvensjonell tetrad disseksjon kan resultere fra kombinasjoner av flere faktorer. En faktor er den økte tap av ellers levedyktige sporer, som kan følge av adhesjon til glassperlene under spredning eller økt spore død på grunn av de mekaniske påkjenninger i prosessen. En annen faktor kan være enkelt plasmid tap under meiose. En tredje faktor kan være en effektiv reduksjon i brukbare kolonier som følge av kolonier med blandede genotyper, anslagsvis ~ 5% av koloniene i vår pilot krysser en. Det er sannsynlig at disse koloniene representerer feil av søster spore separasjon. Fordi den raske fluorescence sortering og spore separasjon tillate innsamling av enorme antall tetrads, er BEST godt rustet til å overvinne nedgang i effektivitet på denne skalaen. Mens fremtidige gjentakelser av BEST kunne øke effektiviteten nærmer seg manuell disseksjon, er det kanskje mer sannsynlig at den nåværende eksponentielle banen DNA-sekvense kapasitet vil raskt kompensere for dette nivået av brukbare belastning tap. Uansett, vil evnen til å utføre tetrad analyse på skalaen som BEST kan påføres aktivere undersøkelser som for tiden er drivverdige ved manuelle metoder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en NIH / NHGRI Genome Scholar / Fakultet Transition Award (K22 HG002908) til AMD og et strategisk partnerskap mellom Institute for Systems Biology og University of Luxembourg. Forespørsler om stammer eller plasmider kan rettes til Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |