ЛУЧШИЙ: Штрих Enabled Секвенирование тетрад

Summary

Штрих Enabled Секвенирование тетрад (BEST) заменяет ручные процессы выделения, нарушая и расстояние тетрады. ЛУЧШИЙ изолирует тетрады с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток на чашках с агаром, отделяет споры при перемешивании со стеклянными шариками, и определяет, какие случайно выстроенные колонии были получены из того же исходного тетрады с использованием молекулярных штрих-кодов.

Abstract

Тетрадного анализа является ценным инструментом для дрожжевых генетики, но кропотливая ручная характер процесса препятствовал его применение в больших масштабах. Штрих Enabled Секвенирование тетрад (BEST) ¹ заменяет ручной процессы выделения, нарушая и расстояние тетрады. ЛУЧШИЙ изолирует тетрады в силу споруляции конкретных GFP слитого белка, который обеспечивает флуоресцентно-активированном сортировки клеток тетрад непосредственно на чашках с агаром, где аск ферментативно переваренных и споры разрушенных и случайным образом, выстроенных на стеклянной бусины обшивки. Гаплоидного колонии затем присваивается сестра спор отношения, т.е. информация о которых споры возник из той же тетрады, с использованием молекулярных штрих-кодов для чтения во время генотипирования. Удаляя узкое ручного вскрытия, сотни или даже тысячи тетрад могут быть выделены в считанные минуты. Здесь мы представляем подробное описание экспериментальных процедур, необходимых для выполнения лучших в дрожжахSaccharomyces CEREVISIAE, начиная с гетерозиготной диплоидной процедить через изоляцию колоний, полученных из гаплоидного мейоза потомства.

Introduction

Мейотических отображение ген, известный как тетрадного анализа, занимает центральное место в дрожжевых генетики. Вкратце, два гаплоидных штаммов, каждый из которых содержит одну копию каждой хромосомы, в паре с образованием гетерозиготное диплоидный штамм с двумя копиями каждой хромосомы, по одному от каждого родителя. Голодающие диплоидных клеток для азота вызывает мейоза (споруляция), в котором хромосомы дублировать, пройти перегруппировку, и разделить на четыре гаплоидных клеток (спор или сегрегантов) с новыми комбинациями аллелей от каждого родителя. Четыре споры, вытекающие из одного мейоза может быть выделен с помощью ручного процесса, называемого тетрад рассечение.

Обычные тетрада рассечение ^2,3, который практически не изменился с момента первой публикации в 1937 году ^4, имеет три цели. Во-первых, клетки, которые подверглись мейоза (тетрад) должны быть изолированы от фоне вегетативных клеток. В обычном анализе, это достигается путем исследователя, который, используямикроскоп, визуально идентифицирует тетрады на чашке с агаром, и использует микроманипулятор аппарат визуально идентифицировать тетрады на чашке с агаром, и с помощью микроманипулятор для перемещения тетраду на область бесклеточной пластины. Далее, четыре споры в тетрады должны быть физически разделены во избежание interspore спаривания. Споры внутри тетрады скрепляются как в сумке, оставшихся в клеточной стенке оригинального диплоидной клетке, и набор interspore мостов ^5. В обычной тетрадного анализа аск удаляется путем ферментативного пищеварения, и исследователь использует микроманипулятор сломать interspore мосты и дразнить друг от друга споры. Наконец, отдельные споры облеченные в решетчатой ​​узором, который поддерживает связь между спорами, то есть все потомство в ряду четырех являются сестра споры той же исходной тетрады. Опытный дрожжи исследователь может завершить процесс рассечения 10 тетрады (общепринятая минимальное количествоза крест) в 15 мин.

Мы разработали новую высокой пропускной метод тетрада генотипирования, которое мы называем Б arcode E nabled S equencing Т etrads (BEST) ^1. ЛУЧШИЙ расширяет текущих методов в высокой пропускной генетики, позволяя генерацию и генотипирование большого количества потомства, которые изолированы, генотипированных, и поддерживается как лиц и организаций в манере, которая позволяет сестринские споры отношения всех четырех мейотических продуктов, которые будут восстановлены. Это достигается с помощью трех основных стратегий (рис. 1). Во-первых, это введение репортерной конструкцией, которая маркирует клетки, которые подверглись мейоза с GFP и позволяет им быть изолированы с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS). Во-вторых, включение очень сложной штрих-кода ДНК (строка 15 случайных нуклеотидов) в форме, которая передается на все четыре спор тетрады и может быть прочитан секвенирования ДНК рекомбинантного Progenу и, таким образом, определяет родственные спор из одной тетрады. В-третьих, это шаг генотипирование, и ЛУЧШИЙ совместим с многочисленными генотипирования платформ, которые захватывают и набор геномных маркеров, а также тетрада конкретных штрих. Мы используем сайт рестрикции ДНК-ассоциированной последовательности тэгов (RAD-SEQ ⁶⁾ метод, который направляет секвенирование генома с конкретными сайтами рестрикции ^1, тем самым захватывая последовательную 2-3% генома штаммов потомства, а также плазмиду переносимых штрих-кода . Восстановление тетрадных отношений наряду с эмпирически-производного генотипирования данных с креста позволяет точно вывод о недостающей информации, в том числе статуса маркеров с низким охватом последовательности и полного генотипа нежизнеспособных (и, следовательно, не читается) лиц. Здесь мы описываем применение метода в наиболее часто используемых микроорганизма для мейоза картография, дрожжей S. CEREVISIAE. Тем не менее, с незначительными замен организма конкретного Ригоспода, например, различные споруляции-специфических белков, слитые с GFP, метод должен быть легко воспроизведению в других микроорганизмов, в том числе организмы, в которых мейотическое отображение значительно более трудоемким или в настоящее время неразрешимыми.

Рисунок 1. Лучший метод. (А) pCL2_BC плазмиды является 2-мкм плазмиды с спорообразования конкретных GFP слияния, устойчивость к G418, и в 15-мерной случайной штрих-кода. Построение плазмиды библиотеки описано в Ludlow и др. ^1. (В) пул штрих плазмид превращается в диплоидной деформации от креста. (C) Трансформанты затем выросли на выбор и ~ 10000 трансформированных колоний объединяют и спорулировались. Во время мейоза каждая спор из тетрады наследует совместноеру из штрих плазмиды. (D) Tetrads отделены от unsporulated клеток путем FACS и собирали на чашках с агаром, где они перевариваются и разрушали, чтобы каждый спор, чтобы сформировать колонии. (E) Колонии затем определена в 96-луночных планшетах, phenotyped, и генотипирование. Во генотипирования плазмида штрих считывается и используется для идентификации четырех членов каждой тетрады. Эта цифра была изменена с Ладлоу и др. ^1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Protocol

1. Штамм Строительство и характеристика Построить гетерозиготное диплоидный штамм, который будет использоваться в кресте в результате скрещивания гаплоидных штаммов и выбрав диплоидов 2 или используя естественные гетерозиготное напряжение. Штаммы не должен питать GFP. Убедитесь, что штамм не может расти на YPD 2 + 200 мкг / мл G418. Убедитесь, что штамм способен образуют споры. ЛУЧШИЙ совместим с низким крестов эффективности спорообразования, но требуется частота низкая споруляция увеличивает СУИМ время сортировки. Настройка O / N культуру штамма в 5 мл YPD и расти при перемешивании при 30 ° С Промыть 0,5 мл культуры O / N в три раза с PBS (рН 7,4). Гранул промытые клетки, удалите супернатант и ресуспендируют в 2 мл спорообразования среды 7. Перемешайте клетки при комнатной температуре и ежедневно проверять для формирования тетрадного использованием фазового контраста светового микроскопа с целью 40Х. </ Ол> Оцените спор жизнеспособность кресте обычным вскрытия 2,3 небольшого числа (~ 20) тетрад. Spore жизнеспособность в скрещивания разных слоев деформации широко и непредсказуемо меняется. Тем не менее, априорные ожидания спор жизнеспособности могут быть использованы для оценки эффективности Лучший эксперимента до Трудового и дорогостоящих этапов сохранения и генотипирования штаммов. Таким образом, этот шаг очень рекомендуется. 2. Трансформация диплоидов с библиотеки штрих плазмид Вставьте штрих-кодом плазмиды pCL2_BC в гетерозиготном диплоидной деформации, используя протокол преобразования, описанного в Gietz и Вудс 8 со следующими изменениями. После клетки были инкубированы с трансформированной смеси при 30 ° С в течение 20 мин, добавляют ДМСО до 8% от объема смеси трансформации. Добавление ДМСО было установлено, улучшить эффективность ввода преобразованияп некоторые деформации фоны 9. После стадии тепловой шок, осаждения клеток с кратким центрифугированием, декантируют трансформированной смеси, и промыть клетки осторожно в YPD. Тогда, ресуспендирования клеток в 1 мл YPD и дать им возможность восстановить при комнатной температуре в течение 3 часов без перемешивания. Выбор трансформантов путем посева на YPD + G418 (200 мкг / мл) агаром. Чтобы обеспечить комплексное пул плазмид штрих-кодов, собирают большое количество колоний, например, 5 пластин с ~ 2500 колоний на чашку. После того, как колонии могут видеть (2-3 дня роста при 30 ° C), бассейн трансформантов, тщательно очищая их от тарелки в жидкий YPD + G418 (200 мкг / мл) + 15% глицерина. Vortex этой клеточной суспензии, трансфер в криоконсервации флаконе, и заморозить при температуре -80 ° С. Сделайте отдельный замороженного запаса для каждой пластины. Эти замороженных запасов служить в качестве исходных штаммов для шаге 3.1, а также может быть использован для создания более тетрады на более позднем этапе, если это желательно. </литий> 3. Спорулирующих Библиотеку трансформированных клеток получить штрих тетрад Оживить клетки от замороженных запасов, созданных в 2,3 путем O / N роста в 5 мл YPD + G418 (200 мкг / мл) при 30 ° С при перемешивании. Промывают клетки из O / N культур 3x в PBS (рН 7,4), а затем ресуспендирования клеток в среде споруляции 7 плюс 200 мкг / мл G418. Перемешайте споруляцию культур при комнатной температуре и контролировать споруляции прогресса ежедневно до новых тетрады не прекратили формирования. Как только культура содержит хорошо сформированные тетрады и относительно мало диады, удалить культур от волнения и оставить при комнатной температуре в течение не менее 7 дней. Хотя некоторые кресты могут быть поддаются на тарелку пищеварения и нарушения, как только тетрады сформировали (оценивается как описано в 7.3), дополнительный инкубации (7-10 дней в наших экспериментах) имеет важное значение для других крестов. Таким образом, этот шаг очень рекомендуется. 4. УстановитеСУИМ Ворота Тетрадь Сортировка Мейотически выражена SPS2-GFP слитый на плазмиде pCL2_BC позволяет тетрады в споруляции культуры быть обнаружен и выделен из культуры путем флуоресценции. Следующий протокол был разработан для FACSAria II. Рисунок 2. FACS ворота. Серия из четырех последовательных ворот используется для изоляции тетрады. Ворота, показанные в (а) и (B) помочь уменьшить количество комков. Флуоресцентные события выбраны с воротами в (С). Гистограмма в (D) имеет два пика. События в левой пика в первую очередь тетрады (левая вставка изображений), и события в правой пика, как правило, тетрад с прикрепленным зародыше (справа вставка изображений). Окончательное воротаприменительно к этой гистограмме, чтобы выбрать события, которые в основном четверки (красные столбики). Эта цифра была изменена от Ладлоу, и др. 1. Загрузить спорулированных культуры на сортировщик FACS и созданы две рассеяния вперед и боковой разброс ворота, чтобы исключить мусор, слипаются клеток и клеток на несколько капель (фиг.2А и 2В). Там должно быть население люминесцентных клеток, которые при использовании репортер конструкцию SPS2-GFP включают диады и тетрады 10. Ворота GFP против ФСБ включить эти флуоресцентные события (рис. 2в). В зависимости от фона штамм может быть необходимо включить дополнительный затвор для удаления комков, которые включают тетрады и другие клетки. Если это необходимо, проверьте гистограмму FSC флуоресцентных событий и укажите ворота, который включает мероприятия с нижней FSC (рис. 2D, закрытого мероприятия находятся в красный). Проверьте эффективность т он стробирования режима путем сортировки ~ 1500 тетрады на предметное стекло микроскопа и подсчета доли тетрад лицам, не являющимся тетрад с использованием контрастного микроскопа фаз в 400-кратном увеличении. Процент тетрад можно точно оценить путем подсчета только ~ 200 Общий события, но сортировка ~ 1500 уменьшает количество времени, затрачиваемое на поиск клеток на предметном стекле микроскопа. Кроме того, отношение тетрады, не являющихся тетрады могут быть оценены в шаге 4.5. Периодически проверяйте, что сортировщик точно сообщает количество событий, сортируя 25 тетрады на предметное стекло микроскопа и исследовании клеток, содержащихся в капле с использованием контрастного микроскопа фаз в 400-кратном увеличении. Там должно быть 25 тетрады в капли. Повторите 3-4x для оценки дисперсии прибора FACS. 5. Сортировка Tetrads Onto чашке с агаром p_upload/51401/51401fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/> Рисунок 3. Размещение агаром на сортировщик FACS. Для сортировки тетрады в небольшой капле zymolyase раствор помещают в середине стандарта (круговой) агар пластины, стандартной (100 мм прямоугольная) 96 лунками является первым размещены на стадии клеточного сортера и сортировщик запрограммирован на хранение тетрады в конкретной скважины (в данном случае D5). Затем круговой агар пластина помещается в верхней части 96-луночного планшета и расположены так, что падение zymolyase по центру над указанный хорошо. Теплый нужное количество YPD + G418 (200 мкг / мл) пластинами, по крайней мере, 1,5 ч в инкубаторе 37 ° C, расположенной рядом с сортировщика FACS. Ключевой особенностью протокола сортировки является способность точно нацелены СУИМ сортируются тетрады в определенном месте на чашке с агаром, содержащей пул zymolyase решения. Чтобы сделать это, поместите "ориентир" 96 лунками на тон автоматизирован блок осаждения клеток (ACDU) от сортировщика. Подготовьте схему сортировки который будет сортировать 25 тетрады в одну лунку формате 96-луночного. Выбрать и ближе к середине пластинки, например, хорошо D5. 3 показана чашку Петри и 96-луночный планшет наносили на клеточного сортера. Сортировка 25 тетрады на чашку дает хорошо разделенные колонии. Принесите стопку 10 пластин агара из инкубатора 37 ° C, чтобы сортировщика. Возьмите один агаром и пипеток 25 мкл zymolyase решения (1 мг / мл в 0,7 М сорбит) на агар недалеко от центра пластины. Затем поместите пластину на ориентир 96-луночный планшет, совместив zymolyase капельку над целью и с шага 5.2, например а D5. Запуск рода и хранение 25 тетрады в середине zymolyase капли на чашки с агаром. Затем снимите и накройте тарелку. Повторите шаги 5,4 и 5,5 до 25 тетрады были отсортированы в zymolyase капель на каждой пластине в стопке. </li> Вернуться стопку тетрадных содержащих пластин к 37 ° C инкубатора. Повторите шаги 5,3 через 5,7, пока все тарелки не имеют тетрады. 6. Разделяющие Споры Инкубируют каждый стопку тетрад, содержащих чашках с агаром при 37 ° С в течение 1,5 часов. Удалить пластины из инкубатора, добавить 15-25 стерильной 3 мм стеклянные бусы на чашку, и встряхните пластины в виде стека (или как два штабеля 5 пластин) в течение 3-5 мин. Лучший разделение спор достигается перемещением пластины жестко из стороны в сторону или вперед-назад. Не перемещайте пластины таким образом, что бисером "водоворот" вокруг внешнего края пластины. Оставьте бусинки на пластинах, когда закончите. Поместите стопку пластинок с бисером лицевой стороной вверх в инкубаторе 30 ° C. Получить следующую порцию пластины из инкубатора 37 ° C, и повторите шаг 6,2. Планшеты инкубируют O / N при 30 ° С 7. Сбор Колонии ПослеO / N инкубации при 30 ° С, небольшие колонии должны были сформированы на пластинах. Осторожно снимите пластины из инкубатора, не нарушая стеклянные бусы. Удалите стеклянные бусины, тщательно и быстро обращения тарелки над глубоким контейнера. Контейнер должен быть достаточно глубоким, чтобы поймать шарики не позволяя им подпрыгивать вверх и попал в агар пластины. При нажатии на нижней части пластины в то время как он инвертируется может помочь сместить шарики, которые прилипли к пластине. Эти шарики могут быть повторно использованы тщательной промывки с мылом, промывания и деионизированной водой и стерилизации в автоклаве. Подсчитайте количество колоний на каждой пластине и использовать ряд колоний для оценки эффективности разделения и извлечения спор. Например, 25 тетрады на чашку для креста с рядом 100% жизнеспособность может дать в общей сложности 100 колоний на чашку. Из пластин с достаточного количества колоний (> 65 в течение высокого жизнеспособности крестов), передачи клеток из каждого колоНью-Йорк в отдельную лунку 96-луночного планшета, содержащего жидкость YPD + G418. Кроме того, обратите внимание из которых скважин содержать колонии из того же агаром; эта информация будет использоваться, чтобы помочь программное обеспечение назначения тетрадь. Используйте 96-а жидкие пластины, чтобы отобрать культур для генотипирования и для сохранения штаммов как замороженных запасов глицерина. Подробности о последовательности RAD-тега и анализа последовательности может быть найдено в Ludlow и др. 1.

Representative Results

ЛУЧШИЙ может значительно улучшить скорость, с которой споры с тетрад могут быть выделены. В качестве примера пропускной этот метод может поставить, один исследователь выполнял FACS сортировки и разделение спор (шаги 5,1 через 6,3) с 149 чашках с агаром в 3 ч. 1. Эквивалентно доходности (около 3725 тетрады) потребует более 90 ч ручного вскрытия. Тем не менее, как и во многих методов высокой пропускной, текущая итерация метода имеет некоторую потерю эффективности по сравнению с ручной вскрытия. Эта потеря проявляется как уменьшается количество колоний восстановился по сравнению с ожиданием, вычисленным по спор жизнеспособности кресте, определяемой ручного вскрытия (Шаг 1.4). Если предположить, что причины потери спор (обсуждение) влияют споры наугад, оценки могут быть сделаны от того, сколько восстановленные колонии будут членами тетрад, в котором 1, 2, 3 или 4 споры были восстановлены (рис. 4). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = "всегда"> Рисунок 4. Моделирование эффективности метода на уровне тетрадного. Failure для успешного восстановления споры (как колоний) может быть связано с спор нежизнеспособности, спор адгезией к стеклянных шариков, неспособность отделить споры друг от друга, и т.д. был использован биномиального распределения для расчета ожидаемой доли тетрад (по крайней мере с одной успешно восстановленной споры) получение 4, 3, 2 или 1 колонии на основе доли всех спор успешно восстановлены. Этот график может служить в качестве приблизительного ориентира к числу штаммов, которые в конечном итоге будут собраны в 3 – или 4 – спор тетрады. По мере увеличения числа колоний на чашку растет, растет число полных тетрад восстановлены. В описанном выше эксперименте, 25 тетрады от креста с спор жизнеспособности близка к 100% (как опрermined вручную вскрытия) 1 высевали на чашки с агаром 149. В этом эксперименте максимальное количество колоний, наблюдаемых на пластине было 80, что указывает на 20 спор не удалось образовывать дискретные колонии. Среднее число колоний на чашку было 62. Колонии от 61 чашках, содержащих 65 или более колоний собирали и секвенировали. Из штаммов 3700, которые прошли контроль качества секвенирования, 72% могут быть назначены в вычислительном 3 – или 4 – спор тетрады.

Discussion

Многие направления исследований генетики, начиная от комплексного картографирования признака ¹¹ к изучению механизмов, лежащих в основе рекомбинации ДНК ^12, требуют чрезвычайно большое количество потомства и большие объемы секвенирования ДНК. Методы, которые вступают в брак силу традиционных подходов с мощностью высокой пропускной последовательности ДНК имеют потенциал, чтобы исследования, которые ранее были неразрешимыми. Хотя несколько высокой пропускной методы дрожжей генетики были эффективно применены к конкретным проблемам, каждый из них имеет ограничения, которые не достигают широкой применимости обычной тетрадного анализа. ЛУЧШИЕ решает эти задачи за счет использования высокой пропускной подход, сочетающий тетрадный рассечение и генотипирования потомство дрожжей крестов. В сочетании с мультиплексированном RAD-тега секвенирования, ЛУЧШИЙ предлагает недорогой способ собрать информацию генотип для каждого штамма потомства при сохранении тетрадного отношения с помощью уникальных тетрадных штрих-кодов.0; Из всех в настоящее время используется высокие методы пропускной, ЛУЧШИЙ наиболее тесно повторяет информацию, представленную вручную расчлененного креста дрожжей.

ЛУЧШИЙ имеет две ключевые особенности. Первый состоит в использовании FACS быстро изолировать тетрады от unsporulated клеток в культуре (Протокол шаги 5-6). Возможность изолировать тысячи люминесцентных событий (тетрад) дает ЛУЧШИЙ наибольшее усиление пропускной способности. Этот автоматизации обеспечивает еще большее преимущество по сравнению с ручным вскрытия для скрещивания с низкой эффективностью споруляции, в связи с увеличением времени, необходимого для визуального определения редких событий. Функция второй ключ является использование очень сложной молекулярной штрих-кода (Протокол Шаг 2), которая передается каждому сестра споры о тетрады. Поскольку эти штрих-коды можно использовать для реконструкции в вычислительном тетрады отношения между спорами, которые были случайным образом распределены по чашке с агаром, необходимость вручную массива ячеек в упорядоченной сетки облегчены. Наконец,потому что молекулярная штрих-кода и ген GFP репортер споруляции конкретных физически связаны (на той же плазмиде), всего тетрады, которые сохранили молекулярную штрих-кода выбираются FACS сортировки.

Есть два соображения, которые регулируют длительность времени, что культуры должны инкубируют в споруляции среды. Во-первых, потому что споруляция конкретных репортер (SPS2-GFP) выражается в начале мейоза, в одиночку GFP не различает полные 4-спор тетрады из клеток, которые не завершенных мейоза (т.е. диад). В то время как дополнительная СУИМ стробирования может уменьшить количество люминесцентных, неполных тетрад, самый простой способ, чтобы уменьшить эти нежелательные события просто мониторинг споруляции культуры (Шаг 3.3) и исходя раз новые тетрады прекратили формирования. В наших экспериментах, частота диад, отсортированных составляет менее 1%. Во-вторых, в течение некоторого кресты дополнительного времени, проведенного в спорообразования среде при комнатной температуре без перемешивания (Шаг 3.4) сиговыхчительно улучшает разделение тетрадах на стеклянных шариков во время посева ((Протокол Шаг 6). На самом деле, этот шаг является абсолютно необходимым для разрушения некоторых крестах.

Как и все высокие методов пропускной, ЛУЧШИЙ является "шумнее", чем соответствующий традиционного подхода. Умеренное снижение эффективности лучше по сравнению с обычной тетрадного вскрытия может быть результатом комбинации нескольких факторов. Одним из факторов является повышенное выпадение из противном случае жизнеспособных спор, который может возникнуть в результате прилипания к стеклянных шариков во время расширения или увеличения спор смерти из-за механических напряжений процесса. Второй фактор может быть простым потери плазмиды во время мейоза. Третьим фактором может стать эффективным уменьшение используемых колоний в результате колоний со смешанными генотипов, по оценкам, ~ 5% от колоний в нашей пилота пересекает ^1. Вполне вероятно, что эти колонии представляют неудачи разделения спор сестра. Потому что быстрое плавиковыйценции сортировки и разделения спор позволить сбор огромного числа тетрад, ЛУЧШИЙ хорошо оборудована, чтобы преодолеть снижение эффективности по данной шкале. В то время как будущие итерации лучших могли повысить эффективность приближается к ручной вскрытия, это, пожалуй, более вероятно, что нынешний экспоненциальный траектория ДНК секвенирования мощности будет быстро компенсировать этот уровень полезной потери натяжения. Несмотря на это, возможность выполнять тетрадный анализ по шкале, в которой ЛУЧШИЙ могут быть применены позволит исследований, которые в настоящее невозможным ручными способами.

Materials

FACSAria II (Special order unit)	BD Biosciences	–	Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Scientific		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html