Barcode Enabled sekvensering av Tetrads (BEST) ersätter manuella processer för att isolera, störa och avstånd tetrads. BEST isolat tetrader genom fluorescensaktiverad cellsortering på agarplattor, separerar sporerna genom omrörning med glaspärlor, och bestämmer som är slumpvis anordnade kolonier härledda från samma ursprungliga tetrad med molekylära streckkoder.
Tetradanalys är ett värdefullt verktyg för jäst genetik, men det mödosamma manuella karaktären i processen har hindrat dess tillämpning på stora skalor. Barcode Enabled sekvensering av Tetrads (BEST) 1 ersätter manuella processer för att isolera, störa och avstånd tetrads. BEST isolat tetrader i kraft av en sporulering specifika GFP fusionsprotein som tillåter fluorescensaktiverad cellsortering tetrader direkt på agarplattor där ascus enzymatiskt spjälkade och sporerna störs och slumpvis ordning av glaspärla plätering. De haploida kolonierna delas sedan syster spor relationer, det vill säga uppgifter om vilka sporer härstammar från samma tetrad, med hjälp av molekylära streckkoder läses under genotypning. Genom att ta bort flaskhalsen för manuell dissektion, kan hundratals eller tusentals tetrads isoleras på några minuter. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av de experimentella procedurer som krävs för att utföra BÄST i jästenSaccharomyces cerevisiae, som börjar med en heterozygot diploid stam genom isolering av kolonier härledda från den haploida meiotiska avkomma.
Meiotisk gen kartläggning, allmänt känd som tetradanalys, är centralt för jästgenetik. I korthet är två haploida stammar, var och en innehåller en enda kopia av varje kromosom, parad för att bilda en heterozygot diploida stammen med två kopior av varje kromosom, en från varje förälder. Svältande diploida celler för kväve inducerar meios (sporulering) där kromosomerna duplicera, genomgår ombildning, och dela i fyra haploida celler (sporer eller segreganter) med nya kombinationer av alleler från varje förälder. De fyra sporerna till följd av en enda meios kan isoleras genom en manuell process som kallas tetrad dissekering.
Konventionell tetrad dissektion 2,3 som har förändrats relativt lite sedan den ursprungliga publiceringen 1937 4, har tre mål. Först måste celler som har genomgått meios (tetrads) isoleras från en bakgrund av vegetativa celler. I konventionell analys, åstadkommes detta genom en forskare som, med hjälp avett mikroskop identifierar visuellt tetrader på en agarplatta och sysselsätter en mikromanipulator anordning visuellt identifiera tetrader på en agarplatta och med användning av en mikromanipulator för att förflytta tetrad till ett cellfritt område av plattan. Därefter måste de fyra sporer i tetrad fysiskt åtskilda för att förhindra interspore parning. Sporer inom en tetrad hålls samman med både en ascus, återstoden av cellväggen hos den ursprungliga diploid cell, och en uppsättning av interspore bryggor 5. Vid konventionell tetrad analysen ascus avlägsnas genom enzymatisk nedbrytning, och en forskare använder mikromanipulator att bryta interspore broar och retas isär sporerna. Slutligen är de individuella sporer anordnade i en inrutade mönster som bibehåller förhållandet mellan de sporer, dvs all avkomma i en rad av fyra är syster sporer av samma original tetrad. En erfaren jäst forskare kan slutföra processen med att dissekera 10 tetrads (en allmänt accepterad lägsta antalper kors) i ca 15 min.
Vi har utvecklat en ny hög genomströmning tetrad genotypning metod, som vi kallar B arcode E nabled S equencing av T etrads (BEST) 1. BEST utvecklar vidare dagens metoder i hög genomströmning genetik genom att möjliggöra generering och genotypning av stora antal avkomma som är isolerade, genotypade, och underhålls som individer på ett sätt som gör att syster spor relationer av alla fyra meiotiska produkter som skall återvinnas. Detta sker med hjälp av tre huvudstrategier (Figur 1). Först är införandet av en reporterkonstruktion som märker celler som har genomgått meios med GFP och gör att de kan isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). För det andra är införlivandet av en mycket komplex DNA-streckkod (en sträng av 15 slumpmässiga nukleotider) i en form som överförs till alla fyra sporer av en tetrad och kan läsas av DNA-sekvensering av rekombinanta Progeny och därmed identifierar syster sporer från samma tetrad. Tredje är genotypning steget, och BEST är kompatibel med många plattformar som fångar både en uppsättning av genetiska markörer samt tetrad specifika streckkod genotypning. Vi använder ett restriktionsställe-associerade DNA-taggen sekvensering (RAD-punkter) 6 metod som styr genomsekvense till specifika restriktionsställen 1 och därigenom ta ett konsekvent 2-3% av genomet hos avkomman stammar liksom plasmidburna streckkod . Återhämtningen av tetrad relationer tillsammans med den empiriskt härledda genotypning uppgifter från korset gör det korrekt slutsats av information som saknas, inklusive status markörer med låg sekvenstäckning och den fullständiga genotypen av inviable (och därmed omöjlig) individer. Här beskriver vi tillämpningen av metoden i den vanligast använda mikroorganism för meiotisk kartering, jästen S. cerevisiae. Men med mindre substitutioner av organism-specifika reaherrar, t.ex. olika sporulering specifika proteiner smält till GFP, bör metoden vara lätt överföras till andra mikroorganismer, inklusive organismer i vilka meiotisk kartläggning är betydligt mer arbetsintensiv eller närvarande svårlösta.
Figur 1. Bästa metoden. (A) Den pCL2_BC plasmiden är en 2-mikron plasmid med en sporulering specifik GFP fusion, resistens mot G418, samt en 15-mer slumpmässig streckkod. Konstruktion av plasmiden biblioteket beskrivs i Ludlow m fl 1. (B) En pool av streckkodade plasmider transformeras in i den diploida stammen från ett kors. (C) Trans odlas sedan på urval och ~ 10.000 omvandlade kolonier samman och sporulerades. Under meios varje spor av en tetrad ärver en copy av streckkods plasmiden. (D) Tetrads separeras från unsporulated celler genom FACS och samlas på agarplattor, där de bryts ner och störs för att varje spor för att bilda en koloni. (E) Kolonier plockas sedan in i 96-brunnsplattor, phenotyped och genotypas. Under genotypning plasmiden streckkod läses och används för att identifiera de fyra medlemmarna i varje tetrad. Denna siffra har ändrats från Ludlow m fl 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Många områden av genetisk forskning, allt från komplexa drag kartläggning 11 till studier av mekanismerna bakom DNA-rekombination 12, kräver extremt stora antal avkomma och höga volymer av DNA-sekvensering. Tekniker som gifta sig kraften i konventionella inflygningar med kapacitet för hög genomströmning DNA-sekvensering har potential att möjliggöra studier som tidigare svårlösta. Trots att flera hög kapacitet jäst genetik metoder har tillämpats på ett effektivt sätt på specifika problem, har var och begränsningar som inte når upp till den breda tillämpningen av konventionell tetradanalys. BÄSTA adresser dessa utmaningar genom att anställa en hög genomströmning strategi som kombinerar tetrad dissekering och genotypning avkomman av jäst kors. I samband med multiplex RAD-tag-sekvensering, erbjuder BEST ett billigt sätt att få fram genotyp information för varje avkomma stam samtidigt tetrad relationer med hjälp av unika tetrad streckkoder.0; Av alla närvarande används hög genomströmning metoder, BÄST närmast rekapitulerar den information som ett manuellt dissekeras jäst kors.
BEST har två viktiga funktioner. Den första är användningen av FACS för att snabbt isolera tetrads ifrån unsporulated celler i kultur (protokollsteg 5-6). Förmågan att isolera tusentals fluorescerande händelser (tetrads) ger BEST sin största vinst i genomströmning. Denna automatisering ger en ännu större fördel jämfört med manuell dissektion för korsningar med låg sporulering effektivitet, beroende på den ökade tid som krävs för att visuellt identifiera sällsynta händelser. Den andra viktiga funktionen är att använda en mycket komplex molekylär streckkod (Protocol Steg 2) som överförs till varje syster sporer av en tetrad. Eftersom dessa streckkoder kan användas för att beräkningsmässigt rekonstruera tetrad relationer mellan sporer som har slumpmässigt fördelade över en agarplatta, behovet av att manuellt matrisceller i ett beställt rutnät lindras. Slutligeneftersom den molekylära streckkoden och sporulering specifika GFP-reportergenen är fysiskt kopplade (på samma plasmid) används endast tetrader som har behållit den molekylära streckkod väljs genom FACS-sortering.
Det finns två faktorer som styr den tid som kulturer bör inkuberas vid sporulering mediet. För det första, eftersom sporbildningen specifika reportern (SPS2-GFP) uttrycks tidigt i meios, GFP ensamt skiljer inte kompletta 4-spor tetrader från celler som inte har avslutat meios (dvs. dyader). Medan ytterligare FACS slussning kan minska antalet fluorescerande, ofullständiga tetrader, är det enklaste sättet att minska dessa oönskade händelser helt enkelt övervaka sporuleringen kulturen (Steg 3.3) och fortsätter gång nya tetrader har slutat formning. I våra experiment, är frekvensen hos dyader sorterat mindre än 1%. För det andra, för vissa korsningar extra tid i sporulering medium vid rumstemperatur utan omrörning (Steg 3.4) SIGligt förbättrar separationen av tetrader av glaspärlor under plätering ((Protokoll steg 6). Faktum är absolut nödvändigt för att störningar i en del korsningar detta steg.
Liksom alla höga genomströmning metoder är BÄST "bullrigare" än motsvarande konventionella sättet. Den blygsamma minskning av effektiviteten i BEST jämfört med konventionell tetrad dissektion kan leda till kombinationer av flera faktorer. En faktor är den ökade förlusten av annars livskraftiga sporer, vilket kan leda till vidhäftning till glaspärlor under spridning eller ökad spor död på grund av de mekaniska påfrestningar i processen. En annan faktor kan vara enkelt plasmidförlust under meios. En tredje faktor kan vara en effektiv minskning av användbara kolonier till följd av kolonier med blandade genotyper, korsar en uppskattad ~ 5% av kolonier i vår pilot 1. Det är troligt att dessa kolonier representerar misslyckanden syster spore separation. Eftersom den snabba fluorescence sortering och spor separation medger insamling av enorma mängder tetrads är BÄST väl rustad för att övervinna minskar i effektivitet på denna skala. Även framtida upprepningar av BEST kunde öka effektiviteten närmar sig manuell dissektion är det kanske mer troligt att den nuvarande exponentiella banan för DNA-sekvensekapacitet snabbt kommer att kompensera för denna nivå av användbara stam förlust. Oavsett, kommer förmågan att utföra tetradanalys på skalan att som bäst kan användas för undersökningar som för närvarande är omöjligt med manuella metoder.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en NIH / NHGRI Genome Scholar / Fakulteten Transition Award (K22 HG002908) till AMD och ett strategiskt samarbete mellan Institutet för systembiologi och universitetet i Luxemburg. Begäran om stammar eller plasmider bör riktas till Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |