Capture Compound massespektrometri - Et kraftfuldt værktøj til at identificere nye C-di-GMP effektorproteiner
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Der er gjort betydelige fremskridt i løbet af det sidste årti mod identifikation og karakterisering af enzymer involveret i syntesen (diguanylate cyclaser) og nedbrydning (fosfodiesteraser) af den anden messenger c-di-GMP. I modsætning hertil få oplysninger om de molekylære mekanismer og cellulære komponenter, hvorigennem dette signalmolekyle regulerer en bred vifte af cellulære processer. De fleste af de kendte effektor proteiner tilhører Pilz familie eller er degenereret diguanylate cyclaser eller phosphodiesteraser, der har givet op på katalyse og har vedtaget effektorfunktion. Således bedre at definere den cellulære c-di-GMP net i en bred vifte af bakterier eksperimentelle metoder er nødvendige for at identificere og validere nye effektorer for hvilke pålidelige i silico forudsigelser mislykkes.
Vi har for nylig udviklet en ny Capture Compound massespektrometri (CCMS) baseret teknologi som et effektivt redskab til atbiokemisk identificere og karakterisere c-di-GMP-bindende proteiner. Denne teknik er tidligere blevet rapporteret at være gældende for en lang række organismer 1. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den protokol, vi udnytter at sonden sådanne signalering komponenter. Som et eksempel, bruger vi Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk patogen, hvor c-di-GMP spiller en kritisk rolle i virulens og biofilm kontrol. CCMS identificeret 74% (38/51) af de kendte eller forventede komponenter i C-di-GMP-netværk. Denne undersøgelse forklarer CCMS procedure i detaljer, og etablerer det som et stærkt og alsidigt redskab til at identificere nye komponenter involveret i lille molekyle signalering.
Introduction
c-di-GMP er en vigtig anden budbringer, der anvendes af de fleste bakterier til at styre forskellige aspekter af deres vækst og adfærd. For eksempel c-di-GMP regulerer cellecyklusprogression, motilitet og ekspressionen af exopolysaccharider og overflade adhæsiner 2-4. Ved koordinering af sådanne processer C-di-GMP fremmer biofilm dannelse, en proces, der er forbundet med kroniske infektioner af en række sygdomsfremkaldende bakterier 5. c-di-GMP syntetiseres af enzymer kaldet diguanylate cyclaser (DGCs), der huser en katalytisk GGDEF domæne 4. Nogle DGCs besidder en hæmmende websted, ned regulerer cyclase aktivitet ved c-di-GMP binding. Nedbrydningen af c-di-GMP katalyseres af to særskilte klasser af phosphodiesteraser (PDE'er), der huser enten en katalytisk EAL eller HD-GUF domæne 6,7.
Størstedelen af de kendte effektor proteiner, der direkte binder c-di-GMP tilhører en af kun tre klasser af proteiner: katalytiskallieret inaktive GGDEF eller EAL domæner og Pilz-domæner, små molekylære kontakter, der gennemgår konformationsændringer upon c-di-GMP binding 8. DGCs, PDE'er og Pilz proteiner er godt karakteriseret, og deres domæner kan forudsiges i silico relativt sikkert. En særlig interesse er nu fokuseret på identifikation af nye klasser af c-di-GMP effektorer. Nogle C-di-GMP effektorer med forskellige bindende motiver blev beskrevet for nylig, såsom CRP / FNR protein familie Bcam1349 i Burkholderia cenocepacia eller den transkriptionelle regulator FleQ i P. aeruginosa 9,10. Desuden blev C-di-GMP-specifikke riboswitches nylig identificeret og vist at styre genekspression i en C-di-GMP-afhængig måde 11. C-di-GMP bindende motiver af forskellige effektorer kun dårligt bevaret gør bioinformatiske forudsigelser af sådanne proteiner vanskelig. For at løse dette problem har vi udviklet en biokemisk metode, som er baseret på anvendelsen af en C-di-GMP spefikke Capture Compound kombineret med massespektrometri 1,12,13.
Vi har for nylig udviklet en ny trivalent C-di-GMP Capture Forbindelse (CDG-CC, figur 1) 1. Denne kemiske stillads er sammensat af: 1) en C-di-GMP del anvendes som madding til at fange C-di-GMP-bindende proteiner, 2) en UV-fotoaktiverbart reaktiv gruppe anvendes til at tværbinde CDG-CC til de bundne proteiner og 3) et biotin til at isolere de indfangede proteiner under anvendelse af streptavidin-coatede magnetiske perler. CDG-CC kan anvendes til direkte og specifikt fange c-di-GMP effektorer fra kompleks blanding af makromolekyler som cellelysater. Capture Compound baseret og kemiske proteomics tilgange er tidligere blevet rapporteret at være gældende for en lang række organismer, f.eks Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium og P. aeruginosa 1,14.
I denne metodologiske dokument,vi giver en dybtgående beskrivelse af CCMS procedure ved hjælp ekstrakter af P. aeruginosa som et eksempel. Denne undersøgelse fastslår CCMS som et stærkt og alsidigt værktøj til biokemisk identificere nye komponenter involveret i lille molekyle signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Særlig forsigtighed bør tages på flere trin i protokollen. Proteinkoncentrationen er en kritisk parameter med en koncentration på 10 mg / ml er vanskeligt at nå, når cellerne dyrkes under særlige vækstbetingelser (f.eks biofilm eller små kolonier varianter). Således bør pellet resuspension udføres i et lille volumen lysisbuffer. Proteinkoncentrationer kan reduceres til 8 mg / ml. Sammenlignet med metoden offentliggjort af Nesper et al. 1, har vi tilføjet forskellige nukleotider …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
Riferimenti
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You’ve come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O’Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
