كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات
Summary
هنا، نقدم طريقة لدينا أنشئت لإعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في iPSCs الإنسان خالية من التحوير مع فيروس سينداي، والذي يظهر نتائج متسقة وتعزيز الكفاءة.
Abstract
وقبل بضع سنوات، وإنشاء الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) إيذانا ببدء حقبة جديدة في مجال الطب الحيوي. الاستخدامات المحتملة لiPSCs الإنسان تشمل النمذجة التسبب في الأمراض الجينية البشرية، العلاج بالخلايا ذاتي بعد تصحيح الجين، وشخصية فحص المخدرات من خلال توفير مصدر للخلايا المريض أعراض محددة وذات الصلة. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات للتغلب عليها، مثل القضاء على ما تبقى من عامل إعادة برمجة التحوير التعبير بعد الإنتاج iPSCs الإنسان. الأهم من ذلك، يمكن التعبير التحوير المتبقية في iPSCs الإنسان غير متمايزة تعوق التفرقة السليم وتضليل تفسير مرض ذات الصلة في الظواهر المختبر. مع هذا السبب، تم تطوير خالية من التكامل و / أو iPSCs الإنسان خالية من التحوير باستخدام عدة طرق، مثل اتش، نظام piggyBac، ناقلات minicircle، ناقلات episomal، والتسليم المباشر وبروتين توليفها مرنا. ومع ذلك، وكفاءة reprogramming باستخدام أساليب خالية من التكامل منخفضة جدا في معظم الحالات.
هنا، فإننا نقدم وسيلة لعزل iPSCs الإنسان باستخدام سينداي الفيروسات (فيروس RNA) إعادة برمجة النظام القائم. يظهر هذا الأسلوب إعادة برمجة نتائج متسقة وعالية الكفاءة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة على تعدد القدرات في المختبر، ويكون تجديد الذات، والتي يمكن أن تكون مفيدة محتملة لنمذجة المرض، لفحص المخدرات، ووضع العلاجات المستندة إلى الخلايا لعلاج المرض وإصابات الأنسجة. ومع ذلك، hESCs وجود قيود لاستبدال العلاج الخلية بسبب الحواجز المناعية، الأورام والأخلاقية، ودراسة الجينات المرتبطة بالمرض، يمكن أن تكون معزولة hESCs بأمراض محددة من خلال ما قبل الزرع التشخيص الوراثي (PGD) النهج، لكنه لا يزال تحديا تقنيا والتبرعات الجنين نادرة جدا. وترتبط هذه القضايا إلى التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية، مما أدى إلى تطور الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs).
يتم برمجتها iPSCs الإنسان وراثيا من الخلايا الجسمية الكبار الإنسان وتؤوي الجذعية تشبه الخلايا المحفزة ميزات مشابهة لhESCs، مما يجعلها مصدرا مفيدا للطب التجديدي مثل داكتشاف البساط، والنمذجة المرض والعلاج بالخلايا في المريض محددة بطريقة 1،2.
حتى الآن، وهناك العديد من الطرق لتوليد iPSCs الإنسان، بما في ذلك بوساطة فيروس (اتش الارتجاعي و) 3، غير الفيروس بوساطة (نظام BAC وناقلات ترنسفكأيشن) 4 transductions الجينات، والبروتينات نظام التسليم 5-7.
على الرغم من أن تسليم الجينات بوساطة الفيروس يمكن ضمان مستوى معين من الكفاءة، ويمكن أن يترك بصمة ناقلات فيروسية جينية، لأنهم الاندماج في الكروموسومات المضيفة للتعبير عن الجينات إعادة برمجة بطريقة غير المنضبط. حتى عندما التكامل الفيروسية من عوامل النسخ قد تفعيل أو تعطيل الجينات المضيف 8، فإنه يمكن أن يسبب انحراف الوراثية غير متوقعة وخطر تكون الأورام 5،9. من ناحية أخرى، تم الإبلاغ عن الأخذ المباشر من البروتينات أو الحمض النووي الريبي في الخلايا الجسمية، ولكن لديها بعض العيوب مثل كثيفة العمالة، TRANSF المتكررةection، وانخفاض مستوى إعادة برمجة 7،10. حتى episomal وعدم إدماج-اتش، فيروس الغدة المرتبطة، والبلازميد ناقلات لا تزال نسبيا أقل كفاءة 11. لهذه الأسباب، فمن المعقول في اختيار أساليب إعادة برمجة عدم اندماج مع فعالية عالية من الجيل التوجيهية والتشوهات الجينية أقل. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم برمجة سينداي الفيروسات القائمة. ويعرف هذا الأسلوب لتكون غير متكاملة في جينوم المضيف وتنتج باستمرار iPSCs الإنسان دون التكامل التحوير.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية لhiPSCs يحمل وعودا لم يسبق لها مثيل في البيولوجيا الأساسية، والطب الشخصي، وزرع 12. في السابق، وأجيال التوجيهية البشرية اللازمة فيروس الحمض النووي الذي يحتوي على مخاطر الاندماج في الجينوم المضيف، والتي يمكن أن تخلق طفرات جينية ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء المختبر لي لإجراء مناقشات قيمة على المخطوطة. وأيد العمل في المختبر لي من المنح المقدمة من روبرتسون جائزة الباحث نيويورك مؤسسة الخلايا الجذعية من ولاية ماريلاند وصندوق أبحاث الخلايا (TEDCO) الجذعية.
Materials
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
Riferimenti
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
