Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus
Summary
Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.
Abstract
Een paar jaar geleden, de oprichting van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) luidde een nieuw tijdperk in de medische biologie. Mogelijke toepassingen van menselijke iPSCs omvatten modellering pathogenese van menselijke genetische ziekten, autologe celtherapie na gencorrectie en gepersonaliseerde drug screening door middel van een bron van patiënt-specifieke en symptoom relevante cellen. Er zijn echter verschillende hindernissen te overwinnen, zoals het elimineren van de resterende herprogrammering factor transgenexpressie na menselijke iPSCs productie. Wat nog belangrijker is, kunnen de resterende transgene expressie in ongedifferentieerde menselijke iPSCs juiste differentiaties hinderen en misleiden de interpretatie van ziekte-relevante in vitro fenotypes. Met deze reden hebben integratie vrij en / of transgen vrij mens iPSCs ontwikkeld met verschillende methoden, zoals adenovirus, het piggyBac systeem minicircle vector, episomale vectoren, directe eiwitlevering en gesynthetiseerd mRNA. Echter, de efficiëntie van reprogramming gebruik-integratie vrije methoden is vrij laag in de meeste gevallen.
Hier presenteren we een methode menselijke iPSCs isoleren met Sendai-virus (RNA-virus) gebaseerd herprogrammering systeem. Deze herprogrammering werkwijze toont consistente resultaten en hoge efficiëntie kosteneffectieve manier.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een capaciteit om te hernieuwen in vitro en hebben pluripotentie, die nuttig kunnen zijn voor ziektemodel kan, voor drug screening, en cel-gebaseerde therapie te ontwikkelen tegen ziekten en verwondingen te behandelen weefsel. Echter, hESCs een beperking voor celvervangingstherapie vanwege immunologische, oncologische en ethische barrières, en ziekte-gerelateerde genen te bestuderen, kon de ziekte-specifieke hESCs worden geïsoleerd door middel van pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) benaderingen, maar het is nog steeds technisch uitdagend en het embryo donaties zijn vrij zeldzaam. Deze problemen zijn gerelateerd aan de voortgang van stamcel biologie, die heeft geleid tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs).
Human iPSCs zijn genetisch geprogrammeerd zijn van menselijke volwassen somatische cellen en de haven pluripotente stamcel-achtige functies vergelijkbaar met hESCs, waardoor ze een nuttige bron voor regeneratieve geneeskunde, zoals d maaktvloerkleed ontdekking, ziekte modellering en celtherapie in patiënt-specifieke wijze 1,2.
Tot nu toe zijn er verschillende methoden om menselijke iPSCs genereren, waaronder virus-gemedieerde (retrovirus en adenovirus) 3, niet-virus gemedieerde (BAC systeem en vectoren transfectie) 4 gen transductie en eiwit afgiftesysteem 5-7.
Hoewel een levering van virus gemedieerde genen kunnen zorgen voor een zekere mate van efficiency kunnen virale vectoren genetische voetafdruk verlaten, omdat hun integratie in gastheerchromosomen om herprogrammering genen tot expressie ongecontroleerd. Zelfs wanneer virale integratie van transcriptiefactoren kunnen activeren of inactiveren gastheergenen 8, kan het een onverwachte genetische aberratie en het risico van tumorigenese 5,9 veroorzaken. Anderzijds, de directe invoering van eiwitten of RNA in somatische cellen werden gerapporteerd, maar hebben een aantal nadelen, zoals arbeidsintensieve, herhaalde transfectie, en lage niveau van 7,10 herprogrammeren. Zelfs episomale en niet-integrerende adenovirus, adeno-geassocieerd virus en plasmidevectoren zijn nog relatief minder efficiënt 11. Om deze redenen is het aannemelijk niet-integratie herprogrammering methoden met een hoge werkzaamheid van IPSC generatie en minder genetische afwijkingen kiezen. In deze studie gebruiken we een Sendai-virus gebaseerde herprogrammering. Deze methode staat bekend als niet-geïntegreerd in het gastheergenoom produceert het altijd menselijke iPSCs zonder transgen integraties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herprogrammeren van menselijke somatische cellen om hiPSCs houdt ongekende beloften in fundamentele biologie, persoonlijke geneeskunde, en transplantatie 12. Voorheen menselijke iPSC generaties vereist DNA-virus dat integratie risico heeft in het gastheergenoom, waarbij ongewenste genetische mutaties die verdere klinische toepassingen zoals ontwikkeling en transplantatie drugtherapie 13 beperken kan maken. Met deze reden zijn veel studies gerapporteerd naar vector-en-transgen vrij systeem menselijk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen de leden van de Lee lab bedanken voor waardevolle discussies over het manuscript. Werk in de Lee lab werd ondersteund door subsidies van Robertson Investigator Award van New York Stem Cell Foundation en uit Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
Riferimenti
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
