Génération efficace d'origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus
Summary
Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.
Abstract
Il ya quelques années, la mise en place de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) a inauguré une nouvelle ère dans le domaine biomédical. Les usages potentiels des CSPi humaines comprennent la modélisation pathogenèse des maladies génétiques humaines, la thérapie cellulaire autologue après la correction de gène, et le dépistage des drogues personnalisé en fournissant une source de cellules pertinentes et des symptômes spécifiques du patient. Cependant, il existe de nombreux obstacles à surmonter, par exemple en éliminant le facteur de reprogrammation expression transgène qui reste après la production de iPSCs humains. Plus important encore, l'expression du transgène résiduelle dans CSPi humaines indifférenciées pourrait entraver différenciations propres et égarer l'interprétation de la maladie pertinents dans les phénotypes in vitro. Avec cette raison, sans l'intégration et / ou CSPi humaines libre transgènes ont été développés en utilisant plusieurs méthodes, telles que l'adénovirus, le système de piggyBac, vecteur minicercle, vecteurs épisomiques, la livraison directe des protéines et la synthèse de l'ARNm. Cependant, l'efficacité de reprogramming utilisant des méthodes sans rapprochement est très faible dans la plupart des cas.
Ici, nous présentons une méthode pour isoler CSPi humaines en utilisant Sendai-virus (virus à ARN) du système de reprogrammation base. Cette méthode de reprogrammation montre des résultats cohérents et de haute efficacité de manière rentable.
Introduction
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité d'auto-renouvellement in vitro et ont pluripotence, qui pourrait être potentiellement utile pour la modélisation de la maladie, pour le criblage de médicaments, et de développer des thérapies à base de cellules pour traiter les maladies et les blessures des tissus. Toutefois, les CSEh ont une limitation pour la thérapie de remplacement de la cellule en raison de barrières immunologiques, oncologiques et éthiques, et à étudier les gènes liés à la maladie, les CSEh spécifiques à la maladie ont pu être isolés par diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) des approches, mais il est encore techniquement difficile et les dons d'embryons sont assez rares. Ces problèmes sont liés au progrès de la biologie des cellules souches, ce qui a conduit à la mise au point de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs).
CSPi humaines sont génétiquement reprogrammées à partir de cellules somatiques humaines adultes et abritent souches caractéristiques de cellules pluripotentes comme similaires à CSEh, qui les rend une source utile pour la médecine régénérative, comme ddécouverte de tapis, la modélisation des maladies et de thérapie cellulaire chez un patient spécifique de manière 1,2.
Jusqu'à présent, il existe plusieurs méthodes pour générer des CSPi humaines, y compris le virus médiation (rétrovirus et adénovirus) 3, non-virus médiation (système de BAC et les vecteurs de transfection) 4 transductions de gènes et de protéines système de livraison 5-7.
Même si une livraison de gènes du virus médiée peut assurer un certain niveau d'efficacité, des vecteurs viraux peuvent laisser l'empreinte génétique, car ils s'intègrent dans les chromosomes de l'hôte pour exprimer des gènes de reprogrammation d'une manière incontrôlée. Même lorsque l'intégration virale de facteurs de transcription peut activer ou inactiver les gènes de l'hôte 8, il peut provoquer une aberration génétique inattendu et le risque de tumorigenèse 5,9. D'autre part, l'introduction directe de protéines ou d'ARN dans les cellules somatiques ont été rapportés, mais ils ont quelques inconvénients tels que main-d'œuvre, transf répétéeection, et le faible niveau de la reprogrammation de 7,10. Même adénovirus épisomique et sans intégration, virus adéno-associés, et les vecteurs plasmidiques sont encore relativement moins efficace 11. Pour ces raisons, il est plausible de choisir non-intégration des méthodes de reprogrammation avec une grande efficacité de la production iPSC et moins d'anomalies génétiques. Dans cette étude, nous utilisons une reprogrammation base Sendai-virus. Ce procédé est connu pour être non-intégrés dans le génome de l'hôte et produit constamment iPSCs humains sans intégration du transgène.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reprogrammation des cellules somatiques humaines à hiPSCs détient promesses sans précédent dans la biologie fondamentale, la médecine personnelle, et la transplantation 12. Auparavant, les générations iPSC humaines requises virus à ADN qui a un risque d'intégration dans le génome de l'hôte, ce qui peut créer des mutations génétiques indésirables qui limitent d'autres applications cliniques telles que le développement de médicaments et de thérapies de transplantation 13.</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lee pour des discussions utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire Lee a été soutenue par des subventions de Robertson Investigator Award de New York Fondation des cellules souches et du Maryland souches Fonds de recherche sur les cellules (TEDCO).
Materials
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
Riferimenti
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