Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

Summary

Her presenterer vi våre etablert metode for å omprogrammere humane somatiske celler i transgene-free menneskelige iPSCs med Sendai virus, som viser konsistent utfall og forbedret effektivitet.

Abstract

For noen år siden, etablering av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) innledet en ny æra i biomedisin. Potensielle anvendelser av humane iPSCs inkluderer modellering patogenesen av genetiske sykdommer, autolog celle behandling etter gen korreksjon, og tilpasset medikamentscreening ved å gi en kilde for pasientspesifikke og symptom relevante celler. Imidlertid er det flere hindringer å overvinne, som eliminerer resterende omprogrammering faktor transgen ekspresjon etter menneske iPSCs produksjon. Enda viktigere, kan resttransgene uttrykk i udifferensierte menneskelige iPSCs hemme riktig differensiering og villede tolkningen av sykdoms relevant in vitro fenotyper. Med denne grunn har integrering-fri og / eller i transgene-fritt menneskelig iPSCs blitt utviklet ved hjelp av flere metoder, slik som adenovirus, den piggyBac system, minicircle vektor, episomal vektor, direkte protein levering og syntetisert mRNA. Men effektiviteten av reprogramming bruker integrasjonsfrie metoder er ganske lav i de fleste tilfeller.

Her presenterer vi en metode for å isolere menneskelige iPSCs ved hjelp av Sendai-virus (RNA-virus) basert omprogrammering system. Dette omprogrammering metoden viser konsistente resultater og høy effektivitet i kostnadseffektiv måte.

Introduction

Humane embryonale stamceller (hESCs) har en evne til selv-fornyes in vitro og har pluripotency, som kan være potensielt nyttige for sykdom modellering, for drug screening, og for å utvikle cellebaserte terapier for å behandle sykdommen og vev skader. Men hESCs har en begrensning for celle erstatning terapi på grunn av immunologiske, onkologiske og etiske barrierer, og å studere sykdomsrelaterte gener, kan sykdomsspesifikke hESCs isoleres gjennom pre-implantasjon genetisk diagnose (PGD) nærmer seg, men det er fortsatt teknisk utfordrende og embryo donasjoner er ganske sjelden. Disse problemene er knyttet til fremdriften i stamcellebiologi, noe som har ført til utvikling av induserte pluripotente stamceller (hiPSCs).

Menneskelige iPSCs er genetisk omprogrammeres fra menneskelige voksne somatiske celler og havnen pluripotent stamcelle-lignende funksjoner som ligner på hESCs, noe som gjør dem en nyttig kilde for regenerativ medisin som drug oppdagelse, sykdom modellering og celleterapi i pasient-spesifikk måte ^1,2.

Til nå, er det flere metoder for å generere humane iPSCs, inkludert virus-mediert (retrovirus og adenovirus) ^3, ikke-virus-mediert (BAC system og vektorer transfeksjon) ⁴ gen transductions, og protein leveringssystemet ^5-7.

Selv om en leveranse av virus-mediert gener kan sikre en viss grad av effektivitet, kunne virale vektorer forlate genetisk fotavtrykk, fordi de integrere i verts kromosomer å uttrykke omprogrammering gener på en ukontrollert måte. Selv når viral integrering av transkripsjonsfaktorer kan aktivere eller deaktivere verts gener ^8, kan det føre til en uventet genetisk avvik og risiko for tumorigenesis ^5,9. På den annen side ble den direkte innføring av proteiner eller RNA inn i somatiske celler rapportert, men har noen ulemper slik som arbeidskrevende, gjentas transfEL, og lavt nivå av omprogrammering ^7,10. Selv episomal og ikke-integrere adenovirus, adeno-assosiert virus, og plasmidvektorer som fremdeles forholdsvis mindre effektive ^11. For disse grunner, er det plausibelt å velge ikke-integrasjon omprogrammering metoder med høy effekt av iPSC generasjon og færre genetiske avvik. I denne studien bruker vi en Sendai-virus basert omprogrammering. Denne metoden er kjent for å være ikke-integrert i vertsgenomet og konsekvent produserer menneskelige iPSCs uten transgene integrasjoner.

Protocol

En. Utarbeidelse av Cell og Media (Dag 1) Kultur og utvide human fibroblast med DMEM medium inneholdende 10% FBS. Plate humane fibroblaster (figur 1) på en 24-brønn plate med en passende tetthet per brønn på dagen før transduksjon. MERK: Følgende seriefortynning anbefales (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K og 6.25K) fordi ulike celletyper har forskjellige vedlegg evne. Inkuber cellene for en dag i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator, noe som sik…

Representative Results

Vanligvis infiserte fibroblaster ikke viser noen morfologiske endringer i flere dager etter Sendai virus transduksjon, men fem dager senere, begynner de å ha ulike former (figur 1). Som beskrevet i en høyre panelet på figur 1, gjør cellene ikke har typisk fibroblast morfologi lenger. De har en rund form og større kjerne enn cytoplasma. Selv når transduksjon er utført i 80% cellulær confluency, ser det ut som de er mindre konfluent i brønnen etter at de begynner å omprogrammere…

Discussion

Omprogrammering menneskelige somatiske celler til hiPSCs innehar enestående løftene i grunnleggende biologi, personlig medisin, og transplantasjon ^12. Tidligere menneskelige iPSC generasjoner kreves DNA virus som har integrasjon risiko i verten genomet, noe som kan skape uønskede genetiske mutasjoner som begrenser ytterligere kliniske applikasjoner som narkotika utvikling og transplantasjon terapi ^13. Med denne grunn har mange studier blitt rapportert å generere vektor-og transgene-fritt system…

Materials

CytoTune-iPS Reprogramming Kit	invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated	Global stem	GSC-6105M	5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X	invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medium	invitrogen	11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 uM (Stock: 10 mM)
basic fibroblast growth factor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock : 100 ug)
Knock-out serum replacement	Gibco	10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)	invitrogen	11965118
Fetal bovine serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid	GIBCO	21985023	1/1000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	cell signaling	4745S	1/200
mouse monoclonal Oct4 antibody	Santa Cruz	SC-5279	1/1000
Nanog	R&D	AF1997	1/1000
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse	invitrogen	948492	1/2000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium	cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	invitrogen	15596018
picking hood	NuAire	NU-301
dissecting scope	Nikon	SMZ745