Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса
Summary
Здесь мы представляем наш стандартный метод перепрограммирования соматических клеток человека в трансгенных без человека ИПСК с вирусом Сендай, который показывает последовательное исход и повышенную эффективность.
Abstract
Несколько лет назад, создание человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открыла новую эпоху в биомедицине. Потенциальные области применения человеческих ИПСК включают моделирования патогенеза генетических заболеваний человека, аутогенной клеточной терапии после коррекции гена, и персональная проверка лекарств, предоставляя источник конкретного пациента и симптомов соответствующих клеток. Тем не менее, существует несколько препятствия для преодоления, такие как устранение оставшегося фактор перепрограммирования трансгена выражение после производства человека ИПСК. Что еще более важно, остаточная трансгенная экспрессия в недифференцированных человека ИПСК может помешать надлежащие дифференциации и дезинформировать интерпретацию болезни-соответствующей в фенотипов пробирке. С этой причине интеграция свободной и / или трансгенные свободного человека ИПСК были разработаны с использованием нескольких методов, таких как аденовирус, системы PiggyBac, minicircle вектор, эписомные векторы, прямой доставки белков и синтезированы мРНК. Тем не менее, эффективность reprogramming помощью интеграции без методов является довольно низким в большинстве случаев.
Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать человека ИПСК с помощью Сендай-вирус (РНК вируса) на основе системы перепрограммирования. Этот метод перепрограммирования показывает стабильные результаты и высокую эффективность в экономически эффективным образом.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) имеют мощность до самообновлению в пробирке и есть плюрипотентности, который может быть потенциально полезными для моделирования заболевания, для скрининга лекарственных средств, а также разработки клеточной терапии для лечения заболеваний и повреждения тканей. Тем не менее, ЭСК имеют ограничение для заместительной клеточной терапии из-за иммунологических, онкологических и этических барьеров, а также для изучения генов заболеваний, связанных, по конкретным болезням ЭСК могут быть выделены через предимплантационной генетической диагностики (ПГД) приближается, но он по-прежнему технически сложными и эмбрион пожертвования довольно редки. Эти вопросы связаны с прогрессом в биологии стволовых клеток, что привело к развитию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).
Человека ИПСК генетически перепрограммировать от взрослых соматических клетках человека и гавань плюрипотентных клеток-подобные функции стволовых подобные ЭСК, что делает их полезным источником для регенеративной медицины, таких как гОткрытие ковер, моделирование болезней и клеточной терапии в пациент-специфической манере 1,2.
До сих пор, есть несколько методов для создания человека ИПСК, в том числе вирус-опосредованной (ретровируса и аденовируса) 3, не вирус опосредованной (система БАК и векторы трансфекции) 4 гена каскадов, и белок система доставки 5-7.
Хотя поставка вирус-опосредованной генов может обеспечить определенный уровень эффективности, вирусные векторы могут оставить генетический след, потому что они интегрироваться в хромосомы хозяина, чтобы выразить гены перепрограммирования неконтролируемым образом. Даже когда вирусный интеграция факторов транскрипции может активировать или инактивировать гены хост-8, это может вызвать неожиданное генетической аберрации и риск онкогенеза 5,9. С другой стороны, сообщалось прямое введение белков или РНК в соматических клетках, но имеют некоторые недостатки, такие как трудоемкий, при неоднократном TransfАЗДЕЛ, и низкий уровень перепрограммирования 7,10. Даже эписомными и не интеграции аденовирус, вирус адено-ассоциированный, и плазмидные векторы все еще относительно менее эффективным 11. По этим причинам, то вполне вероятно, чтобы выбрать не-интеграционные методы перепрограммирования с высокой эффективностью генерации IPSC и меньше генетических аномалий. В этом исследовании, мы используем перепрограммирование Сэндай вирус основе. Этот метод, как известно, не-интегрированы в геном хозяина и последовательно производит человека ИПСК без трансгенных интеграции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Перепрограммирование соматических клеток человека в hiPSCs проводит беспрецедентные обещания в фундаментальной биологии, личной медицине и трансплантации 12. Ранее человека поколений ИПСК требуется вирус ДНК, которая имеет интеграционный риск в геном хозяина, который может созда?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).
Materials
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
Riferimenti
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
