Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus
Summary
Här presenterar vi vår etablerade metoden för att programmera om mänskliga somatiska celler i transgena fria humana iPSCs med Sendai-virus, som visar konsekvent resultat och ökad effektivitet.
Abstract
För några år sedan, inrättandet av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) inleddes en ny era inom biomedicin. Potentiella användningsområden för mänskliga iPSCs inkluderar modellering patogenes av genetiska sjukdomar, autologa cellterapi efter gen korrigering, och personlig drogscreening genom att tillhandahålla en källa av patientspecifika och symptom relevanta celler. Det finns emellertid flera hinder att övervinna, såsom eliminering av återstående omprogrammering faktor transgen expression efter humana iPSCs produktion. Ännu viktigare, kan rest transgenuttryck i odifferentierade humana iPSCs hämmar ordentlig indelningar och vilseleda tolkningen av sjukdoms relevanta in vitro fenotyper. Med denna anledning har integration fria och / eller transgena fria mänskliga iPSCs tagits fram med hjälp av flera metoder, såsom adenovirus, den piggyBac systemet minicircle vektor, episomala vektorer, direkt protein leverans och syntetiserade mRNA. Men effektiviteten hos reprogramming använder integrationsfria metoder är ganska låg i de flesta fall.
Här presenterar vi en metod för att isolera mänskliga iPSCs med Sendai-virus (RNA-virus) baserad omprogrammering systemet. Denna omprogrammering metod visar konsekventa resultat och hög effektivitet i kostnadseffektivt sätt.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har en förmåga att själv förnya in vitro och har pluripotens, vilket kan vara potentiellt användbara för sjukdomsmodellering, för drogscreening, och att utveckla cellbaserade terapier för behandling av sjukdomar och vävnadsskada. Men hESCs har en begränsning för cellersättningsterapi på grund av immunologiska, onkologiska och etiska hinder, samt för att studera sjukdomsrelaterade gener, kan sjukdomsspecifika hESCs isoleras genom preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) närmar sig, men det är fortfarande tekniskt utmanande och embryodonationer är ganska sällsynta. Dessa frågor är relaterade till framsteg i stamcellsbiologi, vilket har lett till utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs).
Mänskliga iPSCs är genetiskt omprogrammeras från humana vuxna somatiska celler och hamnen pluripotenta stamcellsliknande egenskaper som liknar hESCs, vilket gör dem en användbar källa för regenerativ medicin såsom dmatta upptäckt, modellering sjukdom och cellterapi vid patientspecifikt sätt 1,2.
Tills nu, det finns flera metoder för att generera humana iPSCs, inklusive virusmedierad (retrovirus och adenovirus) 3, icke-virusmedierad (BAC Organ och vektorer transfektion) fyra gense transduktioner och proteinleveranssystem 5-7.
Även en leverans av virusmedierade gener kan garantera en viss nivå av effektivitet, kan virala vektorer lämna genetiska avtryck, eftersom de integreras i värdkromosomer att uttrycka omprogrammering gener på ett okontrollerat sätt. Även när viral integration av transkriptionsfaktorer kan aktivera eller inaktivera värdgener 8, kan det orsaka en oväntad genetisk avvikelse och risken för tumörbildning 5,9. Å andra sidan, var det direkta införandet av proteiner eller RNA till somatiska celler rapporterats, men har vissa nackdelar, såsom arbetskrävande, upprepade transfektion och låga omprogrammering 7,10. Även episomala och icke-integrerande adenovirus, adeno-associerat virus, och plasmidvektorer är fortfarande relativt hög förbrukning 11. Av dessa skäl är det rimligt att välja icke-integration omprogrammering metoder med hög effekt för iPSC generation och färre genetiska avvikelser. I denna studie använder vi en Sendai-virus baserad omprogrammering. Denna metod är känd för att vara icke-integrerad i värdgenomet och konsekvent producerar mänskliga iPSCs utan transgena integrationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omprogrammering mänskliga somatiska celler till hiPSCs rymmer oanade löften i grundläggande biologi, personlig medicin, och transplantation 12. Tidigare mänskliga IPSC generationer krävs DNA-virus som har risk integrering i värdgenomet, vilket kan skapa oönskade genetiska mutationer som begränsar ytterligare kliniska tillämpningar såsom läkemedelsutveckling och transplantationsterapier 13. Med denna anledning har många studier rapporterats att generera vektor-och transgena fria systemet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Lees lab för värdefulla diskussioner om manuskriptet. Arbetet i Lee labbet har finansierats med bidrag från Robertson Investigator Award i New York Stem Cell Foundation och från Maryland Stem Cell Research Fund (TedCo).
Materials
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
Riferimenti
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
