التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR
Summary
وهناك حاجة واحدة الجين الخلية التعبير مقايسة لفهم التغاير الخلايا الجذعية.
Abstract
عدم تجانس السكان الخلايا الجذعية يعوق فهم مفصل لبيولوجيا الخلايا الجذعية، مثل التمايز ميلها نحو الأنساب مختلفة. وحيد الخلية Transcriptome على الفحص يمكن أن يكون نهجا جديدا لتشريح الاختلاف الفردية. قمنا بتطوير خلية واحدة طريقة QRT-PCR، وأكد أن هذا الأسلوب يعمل بشكل جيد في العديد من ملامح التعبير الجيني. في مستوى خلية واحدة، كل خلية الجذعية الجنينية البشرية، تم الفرز حسب OCT4 :: الخلايا إيجابية EGFP، لديه عالية في التعبير OCT4، ولكن على مستوى مختلف من NANOG التعبير. وينبغي أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لاستجواب التغاير السكان.
Introduction
السكان حقيقي النواة معظم العالي غير متجانسة وبالتالي مع تحليل من سكان المجمعة، غالبا ما يكون من الصعب تفسير خصائصها الخلوية. الخلايا الفردية ضمن مجموعة من السكان قد تكون مختلفة بمهارة، ويمكن لهذه الاختلافات لها عواقب هامة للخاصية وظيفة من إجمالي عدد السكان 1، 2. خاصة، ومن المعروف عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أن تكون غير متجانسة، والذي يسبب مستويات مختلفة من تعدد القدرات والإمكانات المتنوعة لمواصفات النسب في طرق مميزة بدقة 3 و 4. على سبيل المثال، تختلف مستضدات سطح الخلية يمكن استخدامها لتصنيف الخلايا الجذعية المحفزة غير متمايزة، (5) ومجموعة أوستن سميث المقترحة مستويات مختلفة من تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية، استنادا على التشكل، الميل التمايز وتبعية يشير مسار 6. وقد افترض هذه الظاهرة في الجنين البشريالخلايا الجذعية شركة الاستثمارات الوطنية 7. في حين أجريت الدراسات الشاملة بين مختلف خطوط الخلايا الجذعية، وليس الخلايا الجذعية فرد واحد، ويمكن أن تكون مثيرة للغاية لتحليل مستويات مختلفة من تعدد القدرات على مستوى خلية واحدة، والتي يحتمل أن يؤثر على قدرات التمايز تجاه كل الأنساب الخلية الجسدية.
يمكن أملت عدم التجانس الخلوية والجزيئية من خلال التنميط النسخ، وهو ما يسمى 'Transcriptome على خلية واحدة' ويؤكد نهج جديدة لقياس مستويات التعبير الجيني 8-10. لتحليل مستويات التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وضعنا بروتوكولا بسيطة، ولكن قوية من خلية واحدة الكمي RT-PCR. أكدنا على فعالية وجدوى من بروتوكول لدينا من خلال مقارنة كل نصف لست] خلية واحدة، وكذلك مجموع الرنا المخفف متسلسل من hESCs، مما أدى إلى الاختلافات التقنية والحد الأدنى من الخلافات. علاوة على ذلك، استخدمنا خط مراسل الوراثية لعزل ع متجانسةopulation من hESCs باستخدام نظام استهداف الجينات. استخدمت ناقلات المانحة لاستهداف OCT4 موضع (OCT4-2A-EGFP-PGK-بورو بناء) وزوج من البلازميدات TALEN 11. أدخلت ناقلات المانحة وزوج من البلازميدات TALEN في hESCs (H9، WA09) باستخدام لدينا nucleofection وبروتوكول اختيار نسيلي وصيانة أجريت hESCs استنادا لدينا بروتوكول روتين 12. أكدنا هذا الخط مراسل الوراثية التعبير عن EGFP لOCT4 التعبير في OCT4 :: EGFP hESCs.
لدينا نتيجة يدل على أن hESCs الفردية (تم الفرز حسب OCT4 :: EGFP الخلايا إيجابية بقوة) عقد مستويات عالية من OCT4 التعبير، ولكن مستويات مختلفة من NANOG التعبير. لذلك، يجب أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لدراسة التغاير السكان من الخلايا الجذعية المحفزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحد التنميط الجيني الخلايا يمكن أن تكون أداة رئيسية للتنبؤ وظيفة من خلية واحدة أو شعب بأكمله. بسبب قيود تقنية، وقد تم تقييد التحليل التنميط الجيني بأكمله إلى المتوسطات السكان. وقد اقترحت الاختلافات في أنماط التعبير الجيني ومستويات بين الخلايا الفردية والمجموعات ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء المختبر لي لإجراء مناقشات قيمة على المخطوطة. وأيد العمل في المختبر لي من المنح المقدمة من روبرتسون جائزة الباحث نيويورك مؤسسة الخلايا الجذعية من ولاية ماريلاند وصندوق أبحاث الخلايا (TEDCO) الجذعية.
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O’Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
