البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها
Summary
وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هي استراتيجية غير مكلفة السريع لدقيقة الشامل القائم على البروتينات الطيف الكمي. نحن هنا لشرح طريقة قوية لإعداد وتحليل مخاليط البروتين باستخدام نهج ريدي التي يمكن تطبيقها على ما يقرب من أي نوع العينة.
Abstract
وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هو وسيلة لقياس بدقة الفروق بين البروتين التعبير العينات باستخدام مطياف الكتلة. يتم تنفيذ وسم ريدي باستخدام إما العادية (الضوء) أو بالديوتيريوم (الثقيلة) أشكال الفورمالديهايد والصوديوم cyanoborohydride إضافة إلى اثنين من مجموعات الميثيل إلى كل أمين الحرة. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول قوية لوضع العلامات وريدي مقارنة كمية من خليط من البروتين المعقدة. يتم هضمها عينات البروتين للمقارنة في الببتيدات، وصفت لتنفيذ إما خفيفة أو ثقيلة الميثيل به، مختلطة، وشارك في تحليل من قبل LC-MS/MS. وكميا وفرة البروتين النسبية بمقارنة المناطق الذروة ايون اللوني من الإصدارات الثقيلة والخفيفة وصفت من الببتيد المكونة المستخرجة من كامل أطياف MS. الطريقة الموضحة هنا يشمل إعداد عينة من عكس المرحلة استخراج المرحلة الصلبة، ووضع العلامات ريدي على عمود من الببتيدات، الببتيد تجزئة من قبل القس درجة الحموضة الأساسيةersed المرحلة (BPRP) اللوني، وStageTip تنقية الببتيد. نحن نناقش مزايا وقيود وضع العلامات ريدي فيما يتعلق بأساليب أخرى لإدماج النظائر مستقرة. نسلط الضوء تطبيقات جديدة باستخدام الوسم ريدي كوسيلة سريعة وغير مكلفة، ودقيقة للمقارنة بين تركيزات البروتين في أي نوع تقريبا من العينة.
Introduction
قياس الاختلافات تركيز العديد من البروتينات المعقدة بين العينات هو التحدي الرئيسي في البروتينات. على نحو متزايد، ويجري ذلك عن طريق وضع العلامات البروتينات في كل عينة مع العلامات النظائر المختلفة، والجمع بين العينات، واستخدام مطياف الكتلة لقياس الاختلافات التركيز. توجد عدة طرق لوضع العلامات النظائر مستقرة من البروتينات والببتيدات 15 N وضع العلامات 1 و 2 SILAC إدخال تسميات النظائر عملية الأيض في الجسم الحي، في حين ICAT 3، 4 iTRAQ، والحد من dimethylation 5 إضافة علامات النظائر مستقرة بعد استخراج البروتين والهضم. بين هذه الأساليب، dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) تكتسب شعبية باعتبارها، طريقة استنساخه غير مكلفة لتحديد الاختلافات تركيز البروتين في أي نوع تقريبا من العينة.
ويشمل وضع العلامات ريدي الببتيدات التفاعل مع الفورمالديهايد لتشكيل قاعدة شيف، الذي يتم تخفيض ثمبواسطة cyanoborohydride. رد الفعل هذا dimethylates المجموعات الأمينية الحرة على N-تيرميني والجانب يسين سلاسل وmonomethylates prolines N-محطة. بروتوكول الموصوفة هنا methylates الببتيدات في نموذج 1 مع "النور" التسمية باستخدام الكواشف مع ذرات الهيدروجين في توزيع النظائر الطبيعية وعينة 2 مع تسمية "الثقيل" باستخدام الفورمالدهيد بالديوتيريوم وcyanoborohydride (الشكل 1). كل مجموعة أمينية dimethylated على نتائج الببتيد في الفرق الجماعية لل6.0377 دا بين الضوء والأشكال الثقيلة، والذي يعمل على التمييز بين الشكلين باستخدام مطياف الكتلة. على وجه التحديد، وكميا فرة الببتيد النسبية كنسبة من MS1 استخراج المناطق اللوني ايون (MS1 نسبة المساحة الذروة) من الضوء والنسخة الثقيلة لكل زوج الببتيد أيون. يتم احتساب الوفرة النسبية للبروتين مثل نسبة المساحة الذروة MS1 متوسط بين جميع الببتيدات في البروتين. في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول قوية للسلوكجي ريدي التجارب وضع العلامات من قبل LC-MS/MS يتضمن عكس المرحلة الببتيد المرحلة الصلبة استخراج، ووضع العلامات ريدي على العمود، الببتيد تجزئة بواسطة الرقم الهيدروجيني الأساسية المرحلة (BPRP) اللوني عكسه، وتنقية مخاليط الببتيد باستخدام StageTips (الشكل 2) . نحن نناقش مزايا والقيود المفروضة على استخدام الوسم ريدي لالبروتيوميات الكمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
عدة نقاط تجعل وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات باستخدام dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) وسيلة جذابة للالبروتيوميات الكمية: الكواشف غير مكلفة وضع العلامات (تكلف الكواشف أقل من 1 دولار لكل عينة)، ومعدل رد فعل سريع (~ 10 دقيقة)، وغياب المنتجات الجانبية، وارتفا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
Riferimenti
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
