Protéomique quantitative à l'aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage
Summary
Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon.
Abstract
Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une méthode pour quantifier avec précision les différences d'expression des protéines entre les échantillons à l'aide de la spectrométrie de masse. Étiquetage Redi est réalisée en utilisant soit régulière (lumière) ou deutérés formes (lourds) de formaldéhyde et cyanoborohydrure de sodium à ajouter deux groupes méthyle à chaque amine libre. Ici, nous démontrons un protocole robuste pour l'étiquetage de Redi et la comparaison quantitative de mélanges complexes de protéines. Les échantillons de protéines pour la comparaison sont digérés en peptides, marqués à porter la lumière ou des étiquettes de méthyle lourds, mélangé, et co-analysés par LC-MS/MS. Les abondances relatives des protéines sont quantifiées en comparant les aires des pics du chromatogramme d'ions de versions lourdes et légères marqués du peptide constituant extrait de la MS spectres complet. La méthode décrite ici comprend la préparation d'échantillons par phase inverse extraction en phase solide, en colonne étiquetage de Redi de peptides, un peptide fractionnement par pH rev basephase ersed (BPRP) Chromatographie, et StageTip purification de peptide. Nous discutons des avantages et des limites de l'étiquetage Redi par rapport à d'autres méthodes pour l'incorporation des isotopes stables. Nous soulignons de nouvelles applications utilisant l'étiquetage PENSER comme une méthode rapide, peu coûteux et précis pour comparer l'abondance de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.
Introduction
Mesure des différences de concentration de nombreuses protéines entre les échantillons complexes est un défi central en protéomique. De plus en plus, ce qui est fait par marquage des protéines dans chaque échantillon avec des étiquettes isotopiques, combiner les échantillons, et l'utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier les différences de concentration. Plusieurs méthodes existent pour marquage isotopique stable des protéines et des peptides. 15 N étiquetage 1 et 2 présentent SILAC marqueurs isotopiques métabolique in vivo, alors que iCAT 3, iTRAQ 4, et la réduction diméthylation 5 ajouter des tags sur les isotopes stables après extraction des protéines et la digestion. Parmi ces méthodes, diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) gagne en popularité comme une méthode reproductible peu coûteux à quantifier les différences de concentration de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.
Étiquetage Redi implique peptides réagissant avec du formaldéhyde pour former une base de Schiff, qui est ensuite réduitpar cyanoborohydrure. Cette réaction dimethylates groupes amino libres sur N-terminales et latérales de lysine chaînes et monomethylates ProLines N-terminaux. Le protocole décrit ici méthylation peptides dans l'échantillon 1 avec une étiquette "lumière" en utilisant des réactifs avec des atomes d'hydrogène dans leur distribution isotopique naturelle et de l'échantillon 2 avec une étiquette "lourd" en utilisant du formaldéhyde et du cyanoborohydrure deutéré (Figure 1). Chaque groupe amino diméthylé sur un résultat de peptide dans une différence de masse de 6,0377 Da entre la lumière et les formes lourds, qui est utilisé pour distinguer les deux formes à l'aide d'un spectromètre de masse. Plus précisément, les abondances relatives des peptides sont quantifiées comme étant le rapport des aires de chromatogramme d'ions MS1 extraites (MS1 de rapport de surface de pic) de la lumière et de la version lourde pour chaque paire d'ions peptide. L'abondance relative d'une protéine est calculée comme le rapport médian MS1 de surface de pic parmi tous les peptides dans la protéine. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole robuste pour conduitement Redi expériences de marquage par LC-MS/MS qui comprend peptide extraction en phase inverse en phase solide, en colonne étiquetage de Redi, peptide fractionnement par pH basique en phase inverse (BPRP) Chromatographie, et la purification de mélanges de peptides à l'aide StageTips (Figure 2) . Nous discutons des avantages et des limites de l'utilisation étiquetage PENSER pour protéomique quantitative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs points font stable marquage isotopique des peptides en utilisant une méthode intéressante pour la protéomique quantitative diméthylation réductrice (étiquetage PENSER): réactifs peu coûteux en matière d'étiquetage (réactifs coûtent moins de 1 $ par échantillon), la vitesse de réaction rapide (~ 10 min), l'absence de produits secondaires, hauts reproductibilité (figures 3, 4), produits de réaction stables, la capacité à utiliser toute la protéase, et une grande effica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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