Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling
Summary
Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.
Abstract
Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) ist eine Methode, um genau zu quantifizieren Proteinexpressionsunterschiede zwischen den Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie. Redi Kennzeichnung erfolgt mit entweder regelmäßig (Licht) oder deuteriertes (Schwer-) Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydrid zu zwei Methylgruppen an jedem freien Amin hinzufügen. Hier zeigen wir, einen robusten Protokoll für REDi Kennzeichnung und quantitativen Vergleich von komplexen Proteingemischen. Proteinproben für den Vergleich sind in Peptide, beschriftet, entweder leicht oder schwer Methyl-Tags, gemischt und mittels LC-MS/MS analysiert Co-tragen verdaut. Relative Protein Häufigkeiten werden durch den Vergleich der Ionenchromatogramm Peakflächen von schweren und leichten markierten Versionen der Peptidbestandteil von der vollen MS-Spektren extrahiert quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren umfasst die Probenvorbereitung durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion, On-Column-Redi Markierung von Peptiden, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und StageTip Peptidreinigung. Wir diskutieren Vorteile und Grenzen der redi Kennzeichnung gegenüber anderen Methoden zur stabilen Isotopen Gründung. Wir zeigen neue Anwendungen mit Redi Kennzeichnung als eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode, um die Proteinhäufigkeiten in fast jeder Art von Probe zu vergleichen.
Introduction
Messkonzentrationsunterschiede vieler Proteine zwischen komplexen Proben ist eine zentrale Herausforderung in der Proteomik. Zunehmend wird dies durch Markierung von Proteinen in jeder Probe mit unterschiedlichen Isotopen-Tags, die Kombination der Proben und mit Hilfe der Massenspektrometrie, um Konzentrationsunterschiede zu quantifizieren getan. Es gibt verschiedene Verfahren für stabile Isotopenmarkierung von Proteinen und Peptiden. Kennzeichnung 15 N 1 und 2 SILAC vorstellen Isotopenmarkierungen metabolisch in vivo, während iCAT 3, iTRAQ 4, 5 und Reduktion Dimethylierung nach der Proteinextraktion und Verdauung hinzufügen stabilen Isotopen-Tags. Unter diesen Verfahren wird die reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) an Popularität gewinnt als eine preiswerte, reproduzierbare Methode zur Proteinkonzentration Unterschiede in fast jeder Art von Probe zu quantifizieren.
REDi Markierung beinhaltet die Umsetzung von Peptiden mit Formaldehyd zu einer Schiffschen Base, die dann reduziert wird, zu bilden,von Cyanoborhydrid. Diese Reaktion dimethylates freien Aminogruppen auf N-Termini und Lysin-Seitenketten und monomethylates N-terminale Prolin. Das hier beschriebene Protokoll methyliert Peptide in Probe 1 mit einem "light"-Label unter Verwendung von Reagenzien mit Wasserstoffatomen in ihrer natürlichen Isotopenverteilung und Probe 2 mit einer "schweren" Etikett mit deuteriertem Formaldehyd und Cyanoborhydrid (Abbildung 1). Jeder dimethylierten Aminogruppe auf einem Peptid zu einer Massendifferenz von 6,0377 Da zwischen leichten und schweren Formen, die verwendet wird, um zwischen den beiden Formen mit einem Massenspektrometer zu unterscheiden. Insbesondere werden relativen Häufigkeiten Peptid als das Verhältnis der MS1 extrahiert Ionenchromatogramm Bereiche (Peakflächenverhältnis MS1) von leichten und schweren Version für jedes Peptid Ionenpaar quantifiziert. Die relative Menge eines Proteins wird als Median MS1 Peakflächenverhältnis aller Peptide in dem Protein errechnet. In diesem Bericht beschreiben wir ein robustes Protokoll für das Verhaltening Redi Markierungsexperimente mit LC-MS/MS, die Umkehrphasen-Peptid-Festphasenextraktion, On-Column-Kennzeichnung redi-, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und Reinigung der Peptidgemische mit StageTips (Abbildung 2) umfasst . Wir diskutieren Vor-und Nachteile der Verwendung von Redi Kennzeichnung für die quantitative Proteomik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einige Punkte machen stabilen Isotopenmarkierung von Peptiden mittels reduktiven Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) eine attraktive Methode für die quantitative Proteomik: kostengünstige Markierungsreagenzien (Reagenzien kostet weniger als $ 1 pro Probe), schnelle Reaktionsgeschwindigkeit (~ 10 min), das Fehlen von Nebenprodukten, hohe Reproduzierbarkeit (Fig. 3, 4), stabiler Reaktionsprodukte, die Fähigkeit, eine beliebige Protease verwendet, und hohe Ionisierungseffizienz von markierten Peptiden. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
Riferimenti
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