Стабильный изотоп маркировка пептидов восстановительным Диметилирование (Реди маркировки) является быстрым, недорогим стратегия для точных масс-спектрометрии на основе количественных протеомики. Здесь мы показываем, надежный метод для подготовки и анализа белковых смесей, используя подход Реди, который может быть применен к почти любого типа образца.
Стабильный изотоп маркировка пептидов путем восстановительного Диметилирование (Реди маркировки) является методом для точного количественного различия экспрессии белка между образцами с использованием масс-спектрометрии. Реди маркировка выполняется с помощью либо обычный (свет) или дейтерированных (тяжелые) формы формальдегида и натрия цианоборогидрида добавить две метильные группы к каждому свободного амина. Здесь мы показываем, надежный протокол для Реди маркировки и количественного сравнения сложных белковых смесей. Образцы белка для сравнения перевариваются в пептиды, маркированные нести легком и тяжелом теги метил, смешиваются и совместно анализировали LC-MS/MS. Относительные распространенности белка количественно путем сравнения ион хроматограмме пиков тяжелых и легких меченых вариантов составного пептида, извлеченной из полного MS спектров. Описанный здесь метод включает пробоподготовки обращенно-фазовой экстракции твердой фазы, в колонку Реди маркировки пептидов, пептидов фракционирование по щелочного рН оборотовersed-фаза (BPRP) хроматографии и StageTip очистка пептида. Мы обсуждаем преимущества и ограничения Реди маркировки в отношении других методов стабильных изотопов регистрации. Мы подчеркиваем новых приложений с использованием Реди маркировке быстрой, недорогой и точный метод для сравнения белковых распространенность в почти любого типа образца.
Измерение различия концентрации многих белков между сложных образцов является главной задачей, в протеомики. Все чаще это делается путем маркировки белков в каждом образце с разными тегами изотопных, сочетая образцы, и с помощью масс-спектрометрии для количественного различия концентрации. Существует несколько способов для стабильного изотопного мечения белков и пептидов. 15 N маркировка 1 и 2 SILAC ввести изотопные метки метаболически в естественных условиях, в то время как ICAT 3, iTRAQ 4, и снижение Диметилирование 5 добавить стабильных изотопов метки после экстракции белка и пищеварения. Среди этих методов, восстановительное Диметилирование (Реди маркировка) набирает популярность как недорогой, воспроизводимый метод для количественного различия концентрации белка в почти любого типа образца.
Реди маркировки включает взаимодействие пептидов с формальдегидом с образованием основани Шиффа, которое затем восстанавливаютцианоборогидрид. Эта реакция dimethylates свободные аминогруппы на N-концах и лизин боковых цепей и monomethylates N-концевых пролинов. Протокол, описанный здесь метилирует пептиды в образце 1 с «легкой» этикетки с использованием реагентов с атомами водорода в их естественной распределения изотопного и образца 2 с «тяжелой» этикетки с использованием дейтерированных формальдегид и цианоборгидрид (рис. 1). Каждый диметилированный аминогруппу на пептида, приводит к разнице масс 6,0377 Da между легкой и тяжелой формы, который используется, чтобы различать между двумя формами с помощью масс-спектрометра. В частности, относительное содержание пептида количественно как отношение MS1, выделенных областей ионных хроматограмм (MS1 отношение площади пика) легкой и тяжелой версии для каждой пары пептид ионов. Относительное содержание белка определяется как отношение средней MS1 площади пика среди всех пептидов в белке. В этом докладе мы описываем надежную протокол для проведенияING Реди маркировки эксперименты по LC-MS/MS что включает в себя пептид твердофазного добычу обращенной фазой, на-колонке Реди маркировку, пептидный фракционирования по щелочного рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии и очистка пептидных смесей с помощью StageTips (рис. 2) . Мы обсудим возможности и ограничения использования Реди маркировку для количественных протеомики.
Несколько точек сделать стабильным изотопом маркировки пептидов с использованием привлекательным методом для количественных протеомики восстановительное Диметилирование (Реди маркировки): недорогие реагенты маркировки (реагенты стоить менее $ 1 на образец), высокая скорость реакци?…
The authors have nothing to disclose.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |