Un método modificado para heterotópico Ratón Corazón TRASPLANTE

Summary

A technique is demonstrated for the microsurgical procedure for heterotopic transplantation of hearts in mice, including simplified methods for donor harvesting and recipient vessel anastomosis.

Abstract

Los ratones a menudo se utilizan como donantes de trasplante de corazón y de los beneficiarios en los estudios de la inmunología del trasplante debido a la amplia gama de ratones transgénicos y reactivos disponibles. Una dificultad se presenta debido al pequeño tamaño del animal y los desafíos técnicos considerables de la microcirugía involucrados en el trasplante de corazón. En particular, una alta tasa de fallo técnico poco después del trasplante puede ser consecuencia de la muerte del receptor y las complicaciones postoperatorias tales como parálisis de las extremidades posteriores o un corazón no late. Aquí, la técnica completa para un trasplante cardíaco heterotópico ratón se demuestra, que implica la recolección del corazón del donante y su posterior implante en un ratón receptor. El corazón del donante se cosecha inmediatamente después de la perfusión in situ con solución salina heparinizada fría y transección de la aorta ascendente y la arteria pulmonar. La operación de receptor implica la preparación de la aorta abdominal y la vena cava inferior (VCI), seguido poranastomosis de extremo a lado de la aorta del donante con la aorta destinatario utilizando un solo funcionamiento 10-0 microsutura y una anastomosis similar de la arteria pulmonar del donante con el receptor IVC. Después de la operación el animal se inyecta con 0,6 ml por vía subcutánea con solución salina normal y se le permite recuperarse de una almohadilla térmica 37 ° C. Los resultados de 227 trasplantes de corazón de ratón se resumen con una tasa de éxito a las 48 h de 86,8%. De los 13,2% de fallos dentro de 48 horas, 5 (2,2%) experimentaron parálisis de las extremidades posteriores, 10 (4,4%) tenían un corazón sin latir debido a injertar lesiones y / o trombosis isquémica, mientras que 15 (6,6%) fallecieron dentro de las 48 horas .

Introduction

Los modelos animales de trasplante de órganos pueden proporcionar información valiosa para mejorar el tratamiento de los pacientes con trasplante clínico. Los modelos de ratón son particularmente útiles para estudiar el mecanismo inmunológico de rechazo de trasplante de órgano o aceptación debido a la amplia gama de ratones y reactivos específicos para los ratones que no están disponibles para otros modelos animales ^1-3 modificados genéticamente. Uno de los retos con los modelos de ratón de trasplante es el pequeño tamaño de los donantes y los receptores que requiere considerable habilidad técnica para lograr resultados satisfactorios.

Una técnica fue descrita por primera vez para el trasplante heterotópico de corazón en ratas ⁴ que fue adaptado posteriormente para el trasplante de corazón de ratón por Corry et al ^5. Esta técnica implicó la preparación del receptor antes de la operación de donante y sin perfusión del corazón del donante, ambos de los cuales son susceptibles de comprometer la supervivencia del corazón o t trasplantadoél recibe. El procedimiento ha sido ampliamente utilizado como se describe originalmente para examinar los mecanismos de rechazo de trasplante y la tolerancia ^6-8. Otros han adaptado el procedimiento de trasplante de corazón originales de rata de Ono y Lindsey para trasplantes de corazón en ratones ^9,10. Más recientemente, se publicó una técnica para el ratón trasplante de corazón que se sobrepuso a algunos de los problemas asociados con el método de Corry et al ^11. El protocolo descrito aquí incorpora nuestras modificaciones, basados ​​en el método de Mottram et al ^12, que incluyen: en la perfusión in situ con solución salina heparinizada fría inmediatamente después de la toracotomía y la realización de la operación de donantes antes de la operación destinatario para minimizar el tiempo de operación de receptor. Además, utilizamos pequeñas pinzas atraumáticas vasos en lugar de 6-0 corbatas de seda. Aunque las abrazaderas de los vasos tienen la desventaja de tener más espacio que son más fáciles de controlar que los lazos, que no debe ser demasiado apretado o sueltoy son menos fáciles de eliminar que abrazaderas. Nuestro método utiliza una única sutura continua para la anastomosis recipiente, aunque en el aprendizaje inicial etapas de una alternativa es usar suturas de sujeción en los extremos proximal y distal esquinas para garantizar la uniformidad de las suturas y de este modo la permeabilidad de la anastomosis.

Protocol

Antes del comienzo de los experimentos, obtener la aprobación del Comité de Ética del cuidado animal de la institución pertinente para los experimentos planeados. Mantener los ratones en la conformidad con los requisitos de su institución. El siguiente protocolo ha sido aprobado por los comités de la Universidad de Sydney y el Hospital Royal Prince Alfred. Antes de comenzar la cirugía, todos los instrumentos deben limpiarse a fondo y se esterilizaron por inmersión en etanol al 80%. A…

Representative Results

Después de un periodo de formación inicial, se analizaron 227 casos de ratón heterotópico trasplante de corazón en nuestro grupo. La tasa de éxito dentro de la primera 24 horas fue del 90,3% y a las 48 horas era 86,8%. De los 30 (13,2%) los fallos dentro de 48 horas, 5 (2,2%) experimentaron parálisis de las extremidades posteriores y tuvo que ser sacrificado, 10 (4,4%) tenía un corazón sin latir debido a la lesión de isquemia del injerto y / o trombosis, mientras que 15 (6,6%) fallecieron dentro de las 48 hora…

Discussion

Ratón trasplante de corazón es un método microquirúrgico difícil que requiere considerable habilidad quirúrgica de dominar. El aspecto más difícil es el pequeño diámetro de los vasos. Además, es necesario limitar el tiempo de funcionamiento destinatario y sangrado. La técnica para el trasplante de corazón de ratón fue descrita por primera vez por Corry et al. en 1973 y posteriormente por Mottram et al ^12. Nuestros modificaciones incluyen los siguientes puntos. En primer lugar, …

Materials

Operating microscope	Leica, Heerbrugg, Switzerland	M651	10x – 25x magnification
Anesthetic machine	Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia	Vett3	Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air
Operating board	Hardware store or office supplier		Dense cork or synthetic capable of taking pins
Heparinised saline (5 U/ml, 4oC)	Pfizer, USA	FW25	In 1ml syringe with 23 gauge needle on ice
Normal saline (37oC)	AstraZeneca Pty Ltd, Australia	4538	In 1ml syringe with 23 gauge needle on warm pad
Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl	Ethicon, Inc. NJ, USA	2870G/J421H
Buprenorphine (0.05mg/kg in 0.1ml saline)	Reckitt Benckiser, Sydney, Australia		In 1ml syringe with 23 gauge needle on ice
Ampcillin (5mg/kg in 0.1 ml saline)	Aspen, Sydney, Australia		In 1ml syringe with 23 gauge needle on ice
Gel Foam	Pharmacia & Upjohn Co. USA	801289304	Cut into small pieces
High temperature cautery device	Medtronic, USA	8444000
Microsurgery instruments:	Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,
micro-needleholders	Shanghai, China	WT2020
micro scissors	"          "             "	WT1020
micro-forceps (straight tip)	"          "             "	WA3010
micro-forceps (curved tip)	"          "             "	WA3020
micro-mosquito clamps (1 pair)	"          "             "	W40350
micro-vessel atraumatic clamps (1 pair)	"          "             "	W40130/W40150
Heating Pad/Right Temp	Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790