RNAscope per In situ Rilevamento di trascrizionale attivo Papillomavirus Umano in Cervico Carcinoma a cellule squamose

Summary

La presenza di HPV ad alto rischio in testa e del collo tessuto tumorale è associata a esiti favorevoli. L'RNA recentemente sviluppato nella tecnica di ibridazione in situ chiamata RNAscope permette la visualizzazione diretta di HPV E6/E7 mRNA in sezioni di tessuto FFPE.

Abstract

Il 'gold standard' per la rilevazione di HPV oncogeni è la dimostrazione di trascrizionalmente attivo HPV ad alto rischio nel tessuto tumorale. Tuttavia, l'individuazione di E6/E7 mRNA da parte quantitativa trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (qRT-PCR) richiede l'estrazione di RNA che distrugge il tessuto tumorale contesto critico per la correlazione morfologica ed è stato difficile da adottare nella pratica clinica di routine. Il nostro RNA recentemente sviluppato in tecnologia situ ibridazione, RNAscope, permette la visualizzazione diretta di RNA in, inclusi in paraffina (FFPE) tessuto fissato in formalina con la sensibilità di singola molecola e la risoluzione singola cellula, che consente altamente sensibile e specifica analisi in situ di un biomarker RNA in campioni clinici di routine. Il saggio RNAscope HPV è stato progettato per rilevare la E6/E7 mRNA di sette genotipi HPV ad alto rischio (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58) con un pool di sonde genotipo-specifici. Si è dimostrato eccellente sensibilitàe specificità contro l'attuale metodo 'gold standard' per l'individuazione di E6/E7 mRNA da qRT-PCR. Stato determinato da HPV RNAscope è fortemente prognostico di outcome clinico nei pazienti con cancro orofaringeo.

Introduction

Conti di papillomavirus umano ad alto rischio (HR-HPV) per circa il 5% di tutti i tumori in tutto il mondo ^1. L'incidenza del cancro orofaringeo HPV-associata è aumentata negli ultimi decenni, soprattutto tra gli uomini. Orofaringeo a cellule squamose HPV-positive (OPSCC) probabilmente costituirà la maggioranza di tutti i tumori della testa e del collo negli Stati Uniti nei prossimi 20 anni ^2. Orofaringei carcinomi a cellule squamose causati da HPV sono associati con la sopravvivenza favorevole, e lo stato del tumore HPV è un fattore prognostico forte e indipendente per la sopravvivenza ^3.

Prove per l'attivazione trascrizionale di oncogeni virali E6 ed E7 è considerato il gold standard per la presenza di HPV clinicamente rilevante ^4. Tuttavia, la scoperta di E6/E7 mRNA da tessuto tumorale fresco mediante tecnica RT-PCR non è pratico nella pratica clinica ed è stato limitato ai laboratori di ricerca. Recentemente, abbiamo HAVe ha sviluppato una nuova tecnologia chiamata RNA ISH RNAscope, che consente il rilevamento multiplex in celle singole, con il singolo di RNA sensibilità molecola nei campioni in formalina paraffina fissati incorporati tessuti (FFPE) ^5-10. Abbiamo fornito tre linee di evidenza per singola molecola di rilevamento ^5. In primo luogo, la progettazione e segnale del sistema di amplificazione sonda RNAscope permesso di rilevamento singola copia genomiche HER2 bersagli di DNA in HeLa e SK-BR-3 linee cellulari. In secondo luogo, se confrontato con HER2 segnali di DNA genomico, la distribuzione delle intensità di fluorescenza di punti di segnale HER2 mRNA in cellule HeLa era coerente con una molecola per punto. In terzo luogo, il numero di punti di segnale HER2 mRNA per cella corrisponde strettamente il numero di copie HER2 mRNA stimato mediante un saggio quantificazione basata soluzione, sostenendo ulteriormente rilevamento singola molecola. Inoltre, di contrasto dei nuclei con DAPI in microscopia a fluorescenza o con ematossilina in microscopia in campo chiaro permette la visualizzazione dei singoli nuclei, which a sua volta consente il rilevamento e la quantificazione degli obiettivi di RNA su base singola cellula ^10. La capacità di analizzare l'espressione genica in situ in campioni clinici di routine rende RNAscope una piattaforma promettente per patologia diagnostica, in particolare quelli di tessuto FFPE sezione basata saggi ^10,11. Abbiamo sviluppato un saggio basato HPV-RNAscope per rilevare E6/E7 mRNA di sette genotipi ad alto rischio di HPV (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58) utilizzando un pool di sonde genotipo-specifici. I nostri recenti studi in OPSCC hanno dimostrato che il saggio RNAscope HPV è altamente sensibile e specifico per determinare lo stato di HPV sui tessuti FFPE ^12-17, e anche informa la prognosi in OPSCC ^12,16.

Il principio della tecnologia RNAscope è stato descritto in precedenza ^5. Qui, descriviamo il protocollo completo di analisi RNAscope e dimostrare il suo utilizzo nella rilevazione di HR-HPV in FFPE sezioni di tessuto tumorale.

Protocol

1. Campione, Attrezzatura e Preparazione dei reagenti

1. Tagliare campione di tessuto in blocchi di 3-4 mm di spessore, fissare in fresco 10% formalina neutra tamponata per 16-32 ore a temperatura ambiente (25 ° C) e incorporare in paraffina. Tagliare FFPE in sezioni di 5 ± 1 micron di spessore da blocchi FFPE, montare sezioni su scivoli e aria secca. Nota: Le diapositive possono essere conservati a temperatura ambiente sotto essiccazione per un massimo di 3 mesi. I vetrini di tessuto montati dovrebbero essere cotte in un secco sopra a 60 ° C per 1 ora prima del test RNAscope.
2. Portare ibridazione forno a 40 ° C. Mettere una carta di umidificazione nel Umidità di controllo Cassetto. Aggiungere 50 ml di dH ₂ O del Libro di umidificazione per bagnare completamente. Inserire il vassoio coperto nel forno per preriscaldare per almeno 30 minuti prima dell'uso.
3. Rendere 700 ml 1x Pretrattare 2 Soluzione (10 nl, pH 6 tampone citrato) diluendo 10x Soluzione di pretrattamento in dH ₂ O. Riscaldare il 1x Pretrattare 2 Soluzione a bollire e maintain la temperatura tra 100-104 ° C evitando sovra-bollente.
4. Fai 3 L 1x Wash Buffer (0.1x SSC) diluendo preriscaldata 50x Wash Buffer in dH ₂ O.
5. Preparare 2 x 200 ml di xilene e 2 x 200 ml di 100% EtOH per deparaffinizzazione sotto una cappa aspirante.
6. Preparare il 50% soluzione colorante ematossilina e il reagente brunitura (ammoniaca 0,01%) per il post-colorazione sotto una cappa aspirante.
7. Preparare 200 ml di xilene, 200 ml di 70%, e 2 x 200 ml di EtOH 100% per disidratazione sotto una cappa aspirante.
8. Sonde Preriscaldare target a 40 ° C per 10 min e portare Detection RTU Kit di reagenti a temperatura ambiente, tra cui RTU Amp1, Amp2, Amp3, AMP4, Amp 5-Brown, e AMP6-Brown, tranne cromogeno DAB Brown-A e Brown-B .

2. RNAscope Assay

Deparaffinizzazione e disidratazione

Dopo la cottura, Deparaffinare sezioni di tessuto in xilene per 2 x 5 minuti con agitazione, e disidratarein 100% EtOH per 2 x 3 min sotto agitazione. Asciugare all'aria per 5 min e disegnare una barriera idrofoba intorno alla sezione di tessuto con un idrofobo Barriera Pen.

Pretrattamenti

1. Incubare sezioni di tessuto con Pretrattare 1 per 10 min a RT per tempra di attività della perossidasi endogena, sciacquare in dH ₂ O.
2. Incubare sezioni di tessuto con Pretrattare 2 mantenuti ad una temperatura di ebollizione per 15 minuti per il recupero di RNA, lavare due volte in dH ₂ O.
3. Incubare sezioni di tessuto con Pretrattare 3 per 30 minuti a 40 ° C per la digestione delle proteine ​​in HybEZ forno, lavare due volte in dH ₂ O.

Obiettivo della sonda di ibridazione

Sonde target HPV-HR 7 piscina includono: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58. Aggiungi sonde HPV, ubiquitina C (UBC) e batteriche sonde gene dapB separatamente su tre sezioni di tessuto adiacenti. Ibridare a 40 ° C in forno per 2hr, quindi risciacquare in 1x tampone di lavaggio per 2 x 2 min a RT.

Amplificazione del segnale

1. Incubare sezioni di tessuto con Amp1 (preamplificatore) per 30 min a 40 ° C, Amp2 (sfondo riduttore) per 15 min a 40 ° C, Amp3 (amplificatore) per 30 min a 40 ° C, e AMP4 (sonda etichetta) per 15 min a 40 ° C in forno HybEZ. Dopo ogni fase di ibridazione, sciacquare in 1x tampone di lavaggio per 2 x 2 min a RT.
2. Incubare sezioni di tessuto con AMP5 per 30 min e AMP6 per 15 minuti a RT. Dopo ogni fase di incubazione, sciacquare in 1x tampone di lavaggio per 2 x 2 min a RT.

Rilevamento segnale

Incubare sezioni di tessuto con il 1:1 DAB Miscela miscelando un volume uguale di Brown-A e Brown-B per 10 minuti a RT, lavare due volte in dH ₂ O.

Di contrasto

sezioni di tessuto macchia con soluzione di ematossilina al 50% per 2 min a RT, sciacquare con dH ₂ O fino a quando le diapositive sono chiare mentre il tessuto resta viola. Immergere i vetrini in 0,01% di ammoniaca in dH ₂ O per 5x e seguita con 5 tuffi in dH ₂ O.

Cursore di montaggio

Disidratare sezioni di tessuto a 70%, 100% e 100% EtOH per 2 min ciascuna, xilene per 5 min, montare con un mezzo di montaggio a base di xilene.

Results

Workflow test HPV RNAscope

Il saggio RNAscope ha un flusso di lavoro altamente semplificato che è simile a IHC (Figura 1). Si compone di quattro fasi principali: pretrattamenti, ibridazione, amplificazioni del segnale, e rilevamento. Si avvale di una strategia progettuale sonda unico che garantisce il segnale ad alta fedeltà di amplificazione ^5. Nel saggio RNAscope HPV, sette probe set HR-HPV sono raggruppati, tutti riconosciuta dallo stesso sistema di amplificazione di segnale collegato a perossidasi di rafano (HRP). Segnali di ibridazione specifiche vengono rilevati come precipitati marroni formate da HRP catalizzata reazione cromogena DAB usando come substrato, che può essere facilmente visualizzato mediante microscopia a campo chiaro standard.

Colorazione Rappresentante per la rilevazione dell'HPV

La figura 2 mostra immagini di esempio da macchiati sezioni FFPE della testa e del collo, carcinoma a cellule squamose. Nel caso HPV-positive (Fig.ure 2A), le sonde HR-HPV rilevate forti segnali puntiformi specificamente nelle cellule tumorali. La sonda UBC rilevato numerosi segnali citoplasmatici puntiformi in entrambe le cellule tumorali e cellule stromali (Figura 2B). La sonda gene batterico dapB dimostrato un fondo pulito (Figura 2C). Nel caso HPV-negative, sia la sonda HR-HPV e la sonda dapB rilevati segnali (figure 2D e 2F), mentre segnali forti sono stati rilevati utilizzando la sonda UBC (Figura 2E). In questo saggio, UBC serve come controllo positivo per valutare la qualità del tessuto RNA e dapB come controllo negativo per segnali di fondo. Il punteggio per la determinazione dello status HPV comporta l'esame tutte e tre le diapositive per ciascun caso. Il livello di colorazione sul vetrino di controllo negativo (dapB) cursore serve come cutoff: positività HPV è definita dalla presenza di punctate citoplasmatica e / o colorazione nucleare che era sopra il segnale sul vetrino dabpB.

Figura 1. Diagramma di flusso del test RNAscope. Illustrazione di workflow dosaggio RNAscope. Il saggio RNAscope contiene 4 fasi principali, pretrattamenti, sonda obiettivo ibridazione, amplificazione del segnale e la rilevazione del segnale. L'intera procedura di dosaggio può essere completato in 8 ore. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2. Immagini di esempio di diapositive RNAscope-colorati. Sezioni FFPE colorate con sonde per HR-HPV, UBC (controllo positivo) e dapB (controllo negativo)da due casi HNSCC. AC. Caso HPV-positive. A, espressione HR-HPV E6/E7 mRNA in cellule tumorali. Inset, 40X di ingrandimento per mostrare i segnali puntiformi. B e C) sezioni di tessuto adiacenti che mostrano una colorazione positiva UBC (B) e negativo per dapB (C), rispettivamente. DF) HPV-negative caso. D) nessuna colorazione per l'HPV E6/E7 mRNA , simile al controllo negativo dapB (F). E) UBC colorazione positiva. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Discussion

Il test HPV RNAscope permesso la visualizzazione diretta di E6/E7 mRNA in situ in testa HPV-associata collo e carcinoma a cellule squamose. Il saggio RNAscope è pienamente compatibile con il tessuto tumorale fisso di routine e conserva la morfologia del tessuto per correlazioni istopatologiche (Figura 2). Uno dei principali vantaggi del test RNAscope rispetto ai metodi convenzionali CISH è che amplifica specificamente i segnali di ibridazione (Figure 2B e 2E), senza amplificare il rumore di fondo (Figure 2C e 2F).

In pratica, la procedura di analisi RNAscope HPV può essere completato entro 8 ore o comodamente divisa in due giorni. Il saggio RNAscope HPV è stato utilizzato per determinare lo stato di HPV in testa e del collo carcinoma a cellule squamose ^12-16, dimostrando il 97% di sensibilità e specificità del 93% utilizzando qRT-PCR come metodo di riferimento ^16. Chr convenzionaleISH omogenic per HR-HPV DNA è altamente specifica, ma ha una sensibilità del ¹² ~ 80%. Immunoistochimica (IHC) colorazione per il cellulare surrogato marcatore p16 dimostra sensibilità eccellente, ma può generare risultati falsi positivi ^15,18, soprattutto in nonoropharyngeal tumori testa e collo ^15. L'attuale metodo "gold standard" di qRT-PCR per l'HPV E6/E7 mRNA rilevamento richiede tessuto fresco congelato per ottenere risultati ottimali ed è tecnicamente complessa, che ne limita l'utilizzo solo al laboratorio di ricerca. Inoltre, richiede l'estrazione di RNA che rende impossibile correlare espressione HR-HPV E6/E7 mRNA con istopatologia.

Ci sono diversi fattori critici per il successo del saggio RNAscope. In primo luogo, per i migliori risultati, i tessuti dovrebbero essere fissati in fresco 10% formalina neutra tamponata a temperatura ambiente per 16-32 ore secondo le linee guida ASCO / CAP ^19. In secondo luogo, il forno HybEZ è altamente raccomandato in quanto consentonos controllo ottimale della temperatura e dell'umidità per sonda di ibridazione e gradini amplificazione del segnale. In terzo luogo, è importante rimuovere buffer residuo in eccesso prima di ogni passo, ma ancora mantenere la sezione di tessuto da asciugare durante tali operazioni.

La procedura RNAscope manuale qui descritto è stato completamente automatizzato su un vetrino sistema di auto-colorazione commerciali ^10. Ciò dovrebbe facilitare notevolmente la standardizzazione delle condizioni di saggio e di risparmiare prezioso lavoro manuale nei laboratori di patologia clinica. Inoltre, il software di analisi di immagine dedicato è stato sviluppato ¹⁰ per identificare automaticamente le cellule e segnali di colorazione su un vetrino digitalizzato, che dovrebbe contribuire ad eliminare soggettività e migliorare la riproducibilità nel punteggio.

In sintesi, il saggio RNAscope HPV rileva la presenza di trascritti HR-HPV E6/E7 mRNA in situ nei tessuti FFPE. Ha un flusso di lavoro che è familiare a patologia clinica laboratori per consentire la diretta visualizzazione di questi in sezioni di tessuto. Esso offre una piattaforma ideale per l'esame (FFPE) campioni di tessuto, e può essere facilmente adottata dai laboratori diagnostici di patologia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
di reagenti FFPE
ImmEdge Idrofobica Barriera Penna	Vettore Laboratorio	H-4000
100% EtOH	American Master Tech Scientific	ALREAGAL
Xilene	Fisher Scientific	X3P-1GAL
Gill's Hematoxylin I	American Master Tech Scientific	HXGHE1LT
Idrossido di ammoniaca	Sigma-Aldrich	320145-500mL
Vetro di copertura 24 mm x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-F
Piastra riscaldante	Fisher Scientific	11-300-49SHP
Forno			In grado di mantenere la temperatura a 60± 1 ° C
		d'acqua	In grado di mantenere la temperatura a 40± 1 ° E