Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Sommario

Targeting cellule cerebrali residente per discendenza diretta-riprogrammazione offre nuove prospettive per la riparazione del cervello. Qui si descrive un protocollo di come preparare le culture arricchito da pericytes cervello residente da adulto corteccia cerebrale umana e convertirli in neuroni indotti dall'espressione retrovirus-mediata dei fattori di trascrizione Sox2 e Ascl1.

Abstract

Diretto lignaggio riprogrammazione di cellule non neuronali nei neuroni indotti (INS) può fornire approfondimenti sui meccanismi molecolari alla base neurogenesi e attivare nuove strategie per la modellazione in vitro o la riparazione del cervello malato. Identificazione dei tipi di cellule non neuronali cerebrali residente suscettibili di conversione diretta in Ins potrebbe consentire per il lancio di un tale approccio in situ, cioè all'interno del tessuto cerebrale danneggiato. Qui si descrive un protocollo sviluppato nel tentativo di identificare cellule derivate dal cervello umano adulto che soddisfano questa premessa. Questo protocollo prevede: (1) la coltura di cellule umane dalla corteccia cerebrale ottenuto da biopsie cerebrali adulte umane; (2) l'espansione in vitro (approssimativamente richiede 2-4 settimane) e caratterizzazione di coltura mediante immunocitochimica e citofluorimetria; (3) l'arricchimento da cellule fluorescenza-attivato (FACS) usando anti-recettore PDGF-β e anticorpi anti-CD146;(4) il retrovirus trasduzione mediata con la trascrizione neurogenica fattori Sox2 e ascl1; (5) e, infine, la caratterizzazione della risultante neuroni indotti periciti-derivato (PdiNs) mediante immunocitochimica (14 giorni a 8 settimane dopo trasduzione retrovirale). In questa fase, in possono essere sondato per le loro proprietà elettriche mediante registrazione patch-clamp. Questo protocollo prevede una procedura altamente riproducibile per la conversione in vitro stirpe di pericytes cervello residente in Ins umane funzionali.

Introduzione

Al contrario di riprogrammazione di cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che a loro volta sono dotati di una pletora di potenziali di differenziazione, riprogrammare diretto mira per conversione diretta di uno specifico tipo cellulare in un altro. Per quanto riguarda la loro applicazione nel contesto della modellazione malattie e potenziali terapie a base di cellule, entrambi gli approcci di riprogrammazione hanno vantaggi e svantaggi specifici. Riprogrammazione in iPSCs (i) fornisce una fonte pressoché infinita di cellule; (Ii) consente di ingegneria genetica; (Iii) conferisce con un potenziale di differenziazione quasi illimitate. Tu....

Protocollo

1. Isolamento e Coltura di cellule adulte cervello umano

Gli esperimenti che coinvolgono il tessuto umano devono essere eseguite in conformità a tutte le normative governative e istituzionali pertinenti riguardanti l'uso di materiale umano per scopi di ricerca. Il presente protocollo è stato sviluppato in conformità con l'approvazione da parte del comitato etico della Facoltà di Medicina della LMU di Monaco di Baviera e il consenso informato per iscritto da tutti i pazienti.

Questo protocollo di culture preparazione dell'adulto corteccia cerebrale umana è stata stabilita utilizzando campioni di pazie....

Risultati

Il primo risultato di questo protocollo dopo aver stabilito con successo una cultura da un esemplare di umano adulto corteccia cerebrale consiste nell'identificazione della composizione cellulare della cultura. Immunocitochimica di proteine ​​specifiche di tipo cellulare rivela un notevole grado di eterogeneità tra culture derivati ​​da esemplari di diversi pazienti (Figura 1A). Quantificata mediante citometria di flusso vi è sempre una frazione sostanziale di cellule che esprimono PDGFRβ (in media .......

Discussione

Il presente protocollo descrive l'espansione in vitro e l'arricchimento di cellule pericyte-derivate a seguito isolamento dal adulta corteccia cerebrale umana e la successiva conversione in Ins dall'espressione retrovirus-mediata della trascrizione neurogena fattori Sox2 e Ascl1. Tale protocollo prevede un sistema sperimentale in vitro per studiare la stirpe di conversione delle cellule cerebrali residente in neuroni e potenzialmente anche glia, con l'obiettivo in mente di tradurre in u.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anti-CD140b-PE	BD Biosciences	558821	uso 1:100
anti-CD146-FITC	AbD Serotec	MCA2141FT	uso 1:100
anti-CD13-FITC	AbD Serotec	MVA1270A488T	uso 1:100
anti-CD34-APC	BD Biosciences	560940	uso 1:100
anti-PDGFRβ	Cell Signaling	3169S	uso 1:200
anti-CD146	Abcam	Ab75769	uso 1:400
anti-NG2	Millipore	AB5320	uso 1:400
anti-SMA	Sigma-Aldrich	A2547	uso 1:400
anti-β III-tubulina	Sigma-Aldrich	T8660	uso 1:400
anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M4403	uso 1:200
anti-GFAP	Sigma-Aldrich	G3893	uso 1:600
anti-GFP	Aves Labs	GFP 10-20	uso 1:1.000
anti-RFP	Chromotek	5F8	uso 1:500
anti-S100β	Sigma-Aldrich	S2532	uso 1:300
anti-NeuN	Millipore	MAB377	uso 1:200
anti-GABA	Sigma-Aldrich	A2052	uso 1:500
anti-Calretinina	Millipore	AB5054	uso 1:500
anti-vGluT1	SYnaptic SYstems	135511	uso 1:1.000
Controllo dell'isotipo di Rat IgG1 FITC	AbD Serotec	11-4301-81	uso 1:100
Controllo dell'isotipo IgG1 di ratto PE	AbD Serotec	12-4301-81	uso 1:100
Controllo dell'isotipo IgG1 di ratto APC	AbD Serotec	17-4301-81	uso 1:100
TrypLE	Invitrogen	12605-010
DMEM, glucosio alto, GlutaMAX	Invitrogen	61965
B27 integratore senza siero	Invitrogen
siero fetale di vitello	Invitrogen	10106-169	esegue l'inattivazione del calore mediante incubazione a 56 ° C per 30 min
Penicillina-streptomicina	Invitrogen	15140122
HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks)	Invitrogen	24020-091
PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x)	Invitrogen	14190
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Poli-D-lisina bromidrato (PDL)	Sigma-Aldrich	P0899
PFA (paraformaldeide)	Sigma-Aldrich	P1648
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A9418
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-fenilindolo) dilattato	Sigma-Aldrich	042M4005
Aqua-Poly/ Monta	Polysciences	18606-20
Tubi a fondo tondo in polipropilene	BD Biosciences	352063
Tubi in polistirene a fondo tondo con tappo a filtro cellulare.	BD Biosciences	352235
Piastre a 24 pozzetti	Orange Scientific	5530305
Flaconi per coltura da 75 cm2	Greiner Bio-One	658175
Flaconi per coltura da 25 cm2	Greiner Bio-One	690175
Pipette monouso 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Glass Pasteur pipette (150 mm)	Fisherbrand	FB50251
Vetrini coprioggetti diametro 12 mm	Menzel	CB00120RA1
Bisturi chirurgici monouso	B. Braun	5518083
Piastre per coltura tissutale	Greiner Bio-One	633180
Provette coniche 15 ml	BD Biosciences	352095
			flusso laminare
Centrifuga e rotore oscillante con adattatori per provette da 15 ml e 50 ml	Hettich Lab Technology	1406
Selezionatore di cellule per citometria a flusso: FACSAria l con software FACSDiva	BD Biosciences Incubatore
per colture cellulari umificate	Eppendorf Galaxy 170R
Bagno d'acqua a 37 ° C
FACSFirto della guaina del fluido	BD Biosciences	342003
Microscopio a epifluorescenza BX61	Microscopio confocale Olympus
LSM710	Zeiss

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