Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Summary

Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.

Abstract

Bepalingen op basis van bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET) een gevoelige en betrouwbare manier om eiwit-eiwit interacties in levende cellen te volgen. BRET is de niet-stralingsoverdracht van energie uit een "donor" luciferase-enzym een ​​"acceptor" fluorescent proteïne. In de meest voorkomende configuratie van deze test, de donor is Renilla reniformis luciferase en de acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Omdat het rendement van energie-overdracht is sterk verte-afhankelijke, observatie van de BRET fenomeen vereist dat de donor en acceptor worden in de nabijheid. Om te testen op een interactie tussen twee eiwitten van belang in gekweekte zoogdiercellen, wordt een proteïne uitgedrukt als een fusie met luciferase en de tweede als een fusie met YFP. Een interactie tussen de twee eiwitten van belang kan de donor en acceptor voldoende nauw energieoverdracht optreden brengen. Vergeleken met andere technieken voor het onderzoeken van eiwit-eiwit inwisselwerkingen, de BRET test is gevoelig, vergt weinig hands-on tijd en weinig reagentia, en is in staat om interacties die zwak, van voorbijgaande aard, of afhankelijk van de biochemische milieu binnen een levende cellen zijn te detecteren. Het is daarom een ​​ideale benadering voor het bevestigen mogelijke interacties voorgesteld door gist twee-hybride of massaspectrometrie proteomics onderzoek, en bovendien is het zeer geschikt voor kartering interactie gebieden, waarbij het effect van post-translationele modificaties van eiwit-eiwit interacties en evaluatie van het effect van mutaties die in de patiënt DNA.

Introduction

Zowel klassieke koppeling en next-generation sequencing analyses van menselijke aandoeningen worden het openbaren van de klinische relevantie van eiwitten die betrokken zijn in een reeks van biologische pathways. Het is vaak het geval dat vóór de identificatie in deze studies, is er weinig of geen onderzoek naar de biologische functie van deze eiwitten zijn. Een vruchtbare weg beginnen de biologische functie van een eiwit van belang te bepalen welke andere eiwitten in de fysiologische omgeving interageert met. Karakteriseren van de moleculaire netwerken op deze manier geeft inzicht in de biologische processen die ten grondslag liggen van het menselijk fenotype.

De meest gebruikte grootschalige screening benaderingen voor het identificeren van kandidaat interactie partners voor eiwitten van belang zijn gist twee-hybride screening ¹ en massa-spectrometrie gebaseerde proteomics ^2. Deze methoden kunnen zeer succesvol zijn in het suggereren van potentiële interagerende eiwitten, maar are vals-positieve resultaten. Daarom is de bevestiging van een interactie die door gist twee-hybride of massaspectrometrie screening vereist validatie van de interactie met behulp van een tweede techniek. Typisch een co-immunoprecipitatie of pull-down test wordt gebruikt voor dit doel ^3. Een nadeel van dergelijke technieken voor validatie is de vereiste voor cellysis, die de intracellulaire omstandigheden die essentieel voor het behoud bepaald eiwit interacties kunnen worden vernietigd. Een tweede nadeel is dat zwak of voorbijgaande eiwit interacties tijdens wasstappen kan worden verstoord. Bovendien zijn deze testen vereisen aanzienlijke praktische tijd beperkt het aantal monsters dat gelijktijdig kan worden verwerkt, en vaak tijdrovende optimalisering van reagentia en protocollen.

Om enkele van de problemen in verband met co-immunoprecipitatie experimenten te overwinnen, zijn er verschillende tests ontwikkeld op basis van fluorescentie-en bioluminescent eiwitten die gebruikt kunnen worden in levende cellen. De eerste testen waren gebaseerd op fluorescentie (of Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), de niet-radiatieve energieoverdracht tussen twee fluorescente eiwitten met overlappende emissie-en excitatiespectra ^4. De efficiëntie van de energieoverdracht is sterk afstand afhankelijk, dus observatie van de FRET fenomeen vereist dat de donor en acceptor fluoroforen worden in de nabijheid. Om te testen op een interactie tussen twee eiwitten van belang, wordt een proteïne uitgedrukt als een fusie met het donor-fluorofoor (gewoonlijk cyaan fluorescerend eiwit, GVB) en de tweede als een fusie met de acceptor fluorofoor (gewoonlijk geel fluorescerend eiwit, YFP). Een interactie tussen de twee eiwitten van belang kan de donor en acceptor fluoroforen voldoende nauw energieoverdracht optreden brengen, wat zal resulteren in een meetbare toename van de lichtemissie door het YFP acceptor ten opzichte van de GVB donor. FRET is succesvol detecteren van eiwit-eiwit interacties in levende cellen ⁴ zijn. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van FRET voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties is de vereiste externe verlichting voor excitatie van de donor fluorofoor. Buitenverlichting resulteert in hoge achtergrond in de emissie-signaal, ongewenste excitatie van de acceptor, en fotobleking van donor en acceptor fluoroforen. Deze effecten verminderen de gevoeligheid van de assay voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties.

Een modificatie van de FRET assay die het probleem van hoge achtergrond overwint externe belichting is de bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET) assay ^5,6. In het BRET systeem de donor fluorofoor wordt vervangen door een luciferase-enzym. Dus de energie voor de excitatie van de acceptor fluorofoor wordt gegenereerd in het systeem door de oxidatie van een luciferase substraat, waardoor Buitenverlichting overbodig. In dealgemene configuratie van deze test, de donor Renilla reniformis luciferase en acceptor YFP (voor een bespreking van alternatieve donor en acceptor eiwitten zien Pfleger et al.. ^5). Dienovereenkomstig, in dit systeem, een eiwit van belang gefuseerd aan luciferase en een potentieel interactie eiwit YFP, of vice versa. De BRET test vereist de toevoeging van coelenterazine als een substraat voor luciferase. Omdat coelenterazine is celpermeable, is het mogelijk BRET assays in levende cellen. Echter, inheemse coelenterazine instabiel in waterige oplossing en de enzym-onafhankelijke uitsplitsing van coelenterazine zowel vermindert de concentratie van substraat beschikbaar voor de test genereert en autoluminescence, die de gevoeligheid van metingen van luciferaseactiviteit vermindert. Het gebruik van BRET in levende cellen is vergemakkelijkt door de ontwikkeling van beschermde coelenterazines, die in waterige oplossing stabiel, maar worden gesplitst door cytosolische esterases na diffusie door het celmembraan actief coelenterazine in de cel ⁷ genereren.

Na toevoeging van substraat aan cellen die luciferase-en YFP-fusie-eiwitten, is energieoverdracht gevolg van eiwit-eiwit interacties gekwantificeerd door monitoring emissie van luciferase en YFP. Omdat eiwit interacties direct kan worden gecontroleerd in levende cellen in multi-well platen, de BRET test is een eenvoudige, schaalbare methode voor het valideren van vermeende interacties die is kosten-en tijdbesparend.

Naast valideren vermeende interactors geïdentificeerd proteomische onderzoeksstudies, kan het BRET systeem ook worden gebruikt om testkandidaat interactors gevolg van eerdere biochemische en structurele studies van het eiwit van belang. Zodra de aanwezigheid van een eiwit-eiwit interactie is vastgesteld (hetzij via het BRET assay of andere technieken), de mogelijkheid van de BRET assay emp zijngelegeerd verder om de interactie te karakteriseren. Bijvoorbeeld kan het interagerende regio in kaart gebracht door het genereren afgeknotte versies van de eiwitten, en de betrokkenheid van specifieke resten in de interactie kan worden aangetoond door het creëren puntmutaties. Bovendien kan het modulerende effect van posttranslationele modificaties of kleine moleculen (bijvoorbeeld geneesmiddelen of liganden) van eiwit-eiwit interacties worden onderzocht ^8-10.

De BRET test heeft ook een groot potentieel voor het onderzoek naar mutaties geïdentificeerd in patiënten DNA. Wanneer op een rol voor een mutatie is vastgesteld, het bestuderen van het effect van de mutatie van eiwit-eiwit interacties met BRET kan meer onthullen over de moleculaire etiologie van het fenotype ^11. Sinds de komst van de volgende generatie sequencing methodologieën, het steeds vaker meerdere potentieel schadelijke mutaties worden geïdentificeerd in een individu, in welk geval het duidelijk is welke rele zijnvant het fenotype ^12. In deze situatie kan de BRET test waardevol bij de evaluatie van de impact van de mutaties op de functie van eiwitten en daarmee hun relevantie voor de stoornis.

Protocol

1. Creatie van plasmiden Subkloneren van het cDNA voor elk eiwit van belang in zowel de PLUC en pYFP vectoren, middels standaard moleculair biologische technieken (figuur 1). Voor gedetailleerde protocollen zie Green et al. 13. Sequence alle construeert om te verifiëren dat de eiwitten van belang zijn in frame met de Luc / YFP sequence zonder tussenliggende stopcodons. Voer wens te bevestigen dat de fusie-eiwitten behouden biologische activiteit functi…

Representative Results

Het principe van de BRET test wordt geïllustreerd in Figuur 2. De test opstelling gebruikt in de experimenten die hier voorgesteld wordt in Figuur 3. De detectie van een sterk BRET signaal uit cellen getransfecteerd met een luciferase-YFP fusieproteïne bevestigd dat energieoverdracht waarneembaar was in deze experimentele opstelling (figuur 4). Ons onderzoek richt zich op de rol van het gezin foxp van transcriptionele repressors in ontwikk…

Discussion

Het ontwerp van het fusie-eiwit expressie constructen is een cruciale stap in het opzetten van de BRET assay. In de hier gepresenteerde experimenten werden de eiwitten van belang gefuseerd aan de C-terminus van luciferase of YFP. Het is ook mogelijk en noodzakelijk zijn, eiwitten gefixeerd op de N-terminus van luciferase / YFP. Voor sommige eiwitten, fusies kunnen alleen worden bij de N-of C-terminus aanvaard Om verstoring van de eiwit structuur en functie te voorkomen. Verder is het voor transmembraan eiwitten, waarin …

Materials

Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96 microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.