يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستخراج الرنا صغيرة من مصل الإنسان. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لعزل microRNAs من مصل السرطان للاستخدام في صفائف الحمض النووي وأيضا singleplex PCR الكمي. بروتوكول يستخدم الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف مع بعض التعديلات لانتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية.
تحليل الحمض النووي الريبي والتعبير هو سمة مشتركة في العديد من المختبرات. أهمية هو ظهور الرنا الصغيرة مثل microRNAs، والتي توجد في خلايا الثدييات. هذه الرناوات الصغيرة هي المنظمين الجينات القوية السيطرة على الممرات الحيوية مثل النمو والتنمية والموت والكثير من الاهتمام وقد وجهت في التعبير عنها في سوائل الجسم. ويرجع ذلك إلى التقلبات في الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان وإمكانية تطبيقها والمؤشرات الحيوية مصل هذا. ومع ذلك، فإن تحليل ميرنا التعبير في المصل قد يكون مشكلة. في معظم الحالات من كمية المصل يحد ويحتوي على كميات قليلة من المصل الحمض النووي الريبي مجموع، والتي تشكل الرنا صغيرة فقط 0.4-0.5٪ 1. وبالتالي عزل كميات كافية من نوعية الحمض النووي الريبي من المصل يشكل تحديا كبيرا للباحثين اليوم. في هذه الورقة التقنية، ونحن لشرح الطريقة التي يستخدم فقط 400 ميكرولتر من مصل الإنسان للحصول على الحمض النووي الريبي كافية لصفائف إما DNA أو تحليل QPCR. وعلىdvantages هذه الطريقة هي بساطتها والقدرة على انتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية. لا يتطلب أي أعمدة متخصصة لتنقية الرنا صغيرة وتستخدم الكواشف العامة والأجهزة الموجودة في المختبرات المشتركة. يستخدم أسلوب لدينا قفل جل المرحلة للقضاء على التلوث الفينول بينما في نفس الوقت جودة عالية الغلة الحمض النووي الريبي. ونحن نقدم أيضا خطوة إضافية لمواصلة إزالة جميع الملوثات خلال الخطوة العزلة. هذا البروتوكول هو فعالة جدا في عزل الحمض النووي الريبي غلة إجمالية تصل إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر من المصل ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لالأنسجة البيولوجية الأخرى.
في السنوات الأخيرة، كان هناك دفع المتزايد لاكتشاف مؤشرات حيوية جديدة للكشف المبكر عن الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تركز الكثير من الاهتمام على استخدام الرنا الصغيرة مثل microRNAs 2 (miRNAs أو ميرس) كعلامات محتملة. تم العثور على هذه الرناوات الصغيرة في سوائل الجسم مثل الدم والدراسات أظهرت أنها مقاومة للتدهور ومستقرة على مجموعة من الظروف البيئية المتباينة 3. ونظرا لهذه الميزات miRNAs، المصل أو المتداولة هي العلامات البيولوجية مثالية 4، 5. حاليا هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لعزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل البيولوجية. يستخدم النهج الأول التكنولوجيا القائمة على عمود لربط وأزل الرنا صغيرة 6، بينما يستخدم الأسلوب الثاني البروتوكول طويلة الأمد مع الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف 7. وقد وضعنا بسيطة وفعالة وخالية من الأعمدة بروتوكول لعزل الرنا صغيرة من مصل الإنسان. الحمض النووي الريبي معزولة هو immediately صالحة للاستعمال في التطبيقات المصب، بما في ذلك صفائف قليل النوكليوتيد الحمض النووي RNA والتسلسل.
وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأننا كنا نواجه العديد من القضايا عند استخدام الأساليب القائمة على الفينول لعزل الحمض النووي الريبي من المصل. وكثيرا ما يستخدم النهج Chomczynski التقليدية في معظم المختبرات مع مجموعة من الكواشف المتوفرة من معظم البائعين التجارية. ولكن النظر في استخدامها على نطاق واسع، لم يتم وضع مبادئ توجيهية صارمة لتنتج باستمرار جودة عالية من الحمض النووي الريبي سوائل الجسم، في الدم أو المصل معينة.
المشاكل الشائعة المرتبطة عزل الحمض النووي الريبي من المصل تشمل عوائد منخفضة الحمض النووي الريبي والتلوث مع الكواشف المستخدمة خلال العزلة، ولا سيما الفينول. نهجنا نتخلص من هذه الملوثات الفينول لتوفير الحمض النووي الريبي جودة عالية لتحليل المصب مثل PCR الكمي (QPCR) والحمض النووي الريبي التسلسل. لدينا المزيد من اختبار هذا الحمض النووي الريبي على صفائف ميرنا.
سكان microRNAs يشكل حوالي 0.4-0.5٪ من الحمض النووي الريبي مجموع جدت في مصل الدم. مزيد من هناك أيضا ارتفاع محتوى البروتين وجدت في مصل الدم البشري. لتحسين RNA والبروتين والحد من كل الفينول يلوث قمنا بتعديل النهج Chomczynski التقليدية 9 مع إضافة العديد من الخطوات.
<p class="jove_content" s…The authors have nothing to disclose.
معتمدة سامانثا خوري وباميلا Ajuyah من قبل جائزة الدراسات العليا الاسترالية. نود أيضا أن نعترف شبكة بالحركة أبحاث السرطان، لوي مركز أبحاث السرطان في جامعة نيو ساوث ويلز وحدة أبحاث السرطان الشمالية بالحركة لدعمهم إضافية من سامانثا خوري.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Centre, USA | TR 118 | – |
RNase free H20 | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | – |
Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | – |
Heavy Phaselock Tube | 5PRIME | 2302830 | 2ml capacity |
DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5ml capacity |
Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5mg/ml |
RNA grade Isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
Refrigerated Centrifuge | John Morris | – | – |
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | – | – |
RNA grade Ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
Agilent 2100 Bioanalyser | Agilent, USA | – | – |