Isolatie van Kleine Noncoding RNA's uit humaan serum

Summary

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het extraheren van kleine RNA uit menselijk serum. We hebben deze methode om microRNA kanker serum te isoleren voor gebruik in DNA arrays en ook singleplex kwantitatieve PCR. Het protocol maakt gebruik van fenol en guanidiniumthiocyanaat reagentia met modificaties van hoge kwaliteit RNA opleveren.

Abstract

De analyse van RNA en de expressie ervan is een gemeenschappelijk kenmerk in veel laboratoria. Van belang is het ontstaan ​​van kleine RNAs, zoals microRNAs, die worden aangetroffen in zoogdiercellen. Deze kleine RNA's zijn krachtige gen regelgevers beheersen van vitale routes zoals groei, ontwikkeling en dood en veel belangstelling is gericht op hun expressie in lichaamsvloeistoffen. Dit komt door de ontregeling in menselijke ziekten zoals kanker en hun mogelijke toepassing als serumbiomarkers. Echter, de analyse van miRNA expressie in serum problematisch zijn. In de meeste gevallen is de hoeveelheid serum wordt beperkt en serum bevat geringe hoeveelheden totaal RNA, waarvan slechts kleine RNAs vormen 0,4-0,5% ^1. Dus de isolatie van voldoende hoeveelheden van kwaliteit RNA uit serum is een grote uitdaging voor onderzoekers vandaag. In dit technische document tonen we een werkwijze die op 400 gl menselijk serum gebruikt om voldoende RNA voor zowel DNA arrays of qPCR analyse. De eendvantages van deze werkwijze zijn de eenvoud en het vermogen om hoge kwaliteit RNA opbrengst. Het vereist geen speciale kolommen voor zuivering van kleine RNA's en maakt gebruik van algemene reagentia en hardware gevonden in gemeenschappelijke laboratoria. Onze werkwijze gebruikt een Phase Lock Gel fenol verontreiniging te elimineren terwijl tegelijkertijd de hoge kwaliteit waardoor RNA. We introduceren ook een extra stap om alle verontreinigingen verder te verwijderen tijdens de isolatie stap. Dit protocol is zeer effectief bij het isoleren van totaal RNA opbrengst tot 100 ng / ul uit serum, maar kan ook worden aangepast voor andere biologische weefsels.

Introduction

In de afgelopen jaren is er een groeiende druk om nieuwe biomarkers te ontdekken voor de vroege opsporing van ziekten bij de mens. Veel aandacht is gericht op het gebruik van kleine RNA's zoals microRNA ² (miRNAs of miRs) als potentiële markers. Deze kleine RNAs worden aangetroffen in lichaamsvloeistoffen zoals serum en studies hebben aangetoond ze bestand tegen afbraak en stabiel zijn over een bereik van variërende omgevingsomstandigheden ^3. Gezien deze kenmerken, serum of circuleren miRNAs zijn de ideale biomarker ^{4, 5.} Momenteel zijn er twee belangrijke benaderingen voor het isoleren van kleine RNA uit biologische vloeistoffen. De eerste benadering maakt gebruik van kolommen gebaseerde technologie te binden en elueren de kleine RNAs ^6, terwijl de tweede benadering gebruikt de langdurige protocol met fenol en guanidine thiocyanaat reagentia ^7. We hebben een eenvoudig, effectief, kolomvrije protocol om kleine RNA te isoleren uit humaan serum ontwikkeld. Het geïsoleerde RNA is onmiddellijklijk bruikbaar in afgeleide toepassingen, met inbegrip van DNA-oligonucleotide arrays en RNA sequencing.

Dit protocol is ontwikkeld omdat we werden geconfronteerd met een aantal problemen bij het gebruik van fenol gebaseerde methoden voor het isoleren van RNA uit serum. De traditionele benadering Chomczynski wordt vaak gebruikt in de meeste laboratoria met verschillende reagentia verkrijgbaar bij de meeste commerciële verkopers. Maar gezien de grootschalige toepassing ervan, strenge richtlijnen zijn niet ontwikkeld om consequent produceren hoogwaardige RNA van lichaamsvloeistoffen, met name bloed of serum.

Veel voorkomende problemen in verband met het isoleren van RNA uit het serum onder lage opbrengsten RNA en besmetting met reagentia gebruikt tijdens de isolatie, met name fenol. Onze aanpak elimineert deze fenol verontreinigingen van hoge kwaliteit RNA voor downstream-analyse zoals kwantitatieve PCR (qPCR) en RNA sequencing. We hebben verder getest dit RNA op miRNA arrays.

Protocol

Opmerking: Human serum monsters van gezonde patiënten of patiënten met kanker werden verkregen met geïnformeerde toestemming op grond van goedgekeurde menselijke ethische protocollen van het Royal Prince Alfred Hospital van Sydney (Protocolnummer X10-0016 en HREC/10/RPAH/24) en de University of Technology, Sydney. Serummonsters werden verzameld van patiënten voor de operatie uit verschillende Sydney ziekenhuizen en in opslag bij -80 ° C. 1. Kleine RNA isolatie uit serum <p class="jove…

Representative Results

Figuur 1 toont een typische UV / Vis-spectrum van RNA geïsoleerd uit serum. Uit dit profiel hebben we vastgesteld eiwit verontreinigingen bij 280 nm met fenol en organische verontreinigingen zowel 270 nm en 230 nm respectievelijk. Residu guanidinium thiocyanaat werd waargenomen bij 260 nm. Om verontreinigingen te verminderen, een aantal optimalisatie stappen gezet naar de standaard Tri-reagens RT-LS procedure. We voegden 5 mg / ml glycogeen om zowel de totale RNA opbrengst te verhogen en te verminderen…

Discussion

De bevolking van microRNA vormt ongeveer 0,4-0,5% van het totaal RNA in het serum gevonden. Verder is er ook een hoog eiwitgehalte in humaan serum. RNA verbeteren en zowel eiwit en fenol verontreinigt hebben we de traditionele benadering Chomczynski ⁹ gemodificeerd met de toevoeging van verschillende stappen.

Totaal RNA werd geïsoleerd uit serum met behulp van de standaard Tri-reagens RT-LS (Molecular Research Centre) maar wanneer deze wordt uitgevoerd in ons laboratorium, deze m…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description (optional)
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Centre, USA	TR 118	–
RNase free H20	GIBCO Invitrogen	10977-023	–
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491	–
Heavy Phaselock Tube	5PRIME	2302830	2ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5mg/ml
RNA grade Isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated Centrifuge	John Morris	–	–
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA	–	–
RNA grade Ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyser	Agilent, USA	–	–