मानव सीरम से लघु noncoding RNAs के अलगाव
Summary
इस प्रोटोकॉल मानव सीरम से छोटे RNAs निकालने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. हम डीएनए सरणियों में इस्तेमाल के लिए कैंसर सीरम से microRNAs अलग और भी singleplex मात्रात्मक पीसीआर के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता शाही सेना उपज के लिए संशोधनों के साथ फिनोल और guanidinium thiocyanate अभिकर्मकों का इस्तेमाल करता.
Abstract
शाही सेना और उसकी अभिव्यक्ति का विश्लेषण कई प्रयोगशालाओं में एक आम सुविधा है. महत्व के स्तनधारी कोशिकाओं में पाए जाते हैं जो microRNAs, जैसे छोटे RNAs के उद्भव है. इन छोटे RNAs इस तरह के विकास, विकास और मृत्यु और ज्यादा ब्याज के रूप में महत्वपूर्ण रास्ते को नियंत्रित शक्तिशाली जीन नियामकों शारीरिक तरल पदार्थ में उनकी अभिव्यक्ति के निर्देश पर किया गया है. इस तरह के कैंसर और सीरम बायोमार्कर के रूप में उनके संभावित आवेदन के रूप में मानव रोगों में उनके अनियंत्रण की वजह से है. हालांकि, सीरम में miRNA अभिव्यक्ति की विश्लेषण समस्याग्रस्त हो सकता है. ज्यादातर मामलों में सीरम की मात्रा सीमित है और सीरम छोटे RNAs केवल 0.4-0.5% 1 का गठन जिनमें से कुल शाही सेना के कम मात्रा में होता है. इस प्रकार सीरम से गुणवत्ता शाही सेना की पर्याप्त मात्रा के अलगाव के शोधकर्ताओं के लिए एक बड़ी चुनौती बन गई है. इस तकनीकी पत्र में, हम डीएनए सरणियों या qPCR विश्लेषण के लिए या तो पर्याप्त शाही सेना प्राप्त करने के लिए मानव सीरम की केवल 400 μl का उपयोग करता है जो एक विधि का प्रदर्शन. एकइस विधि के dvantages अपनी सादगी और उच्च गुणवत्ता शाही सेना उपज करने की क्षमता है. यह छोटे RNAs की शुद्धि के लिए कोई विशेष स्तंभों की आवश्यकता है और आम प्रयोगशालाओं में पाया जनरल अभिकर्मकों और हार्डवेयर का इस्तेमाल करता. हमारे विधि एक ही समय में उच्च गुणवत्ता शाही सेना से बेदखल करते हुए फिनोल प्रदूषण को खत्म करने के लिए एक चरण ताला जेल का इस्तेमाल करता. हम भी आगे अलगाव चरण के दौरान सभी को दूर करने के लिए एक अतिरिक्त कदम परिचय. इस प्रोटोकॉल सीरम से 100 एनजी / μl की कुल शाही सेना की पैदावार को अलग करने में बहुत प्रभावी है, लेकिन यह भी अन्य जैविक ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Introduction
हाल के वर्षों में, मानव रोगों का जल्दी पता लगाने के लिए उपन्यास बायोमार्कर की खोज के लिए एक से बढ़ धक्का दिया गया है. बहुत ध्यान संभावित मार्कर के रूप में इस तरह के microRNAs 2 (miRNAs या miRs) के रूप में छोटे RNAs का उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया गया है. इन छोटे RNAs ऐसे सीरम और अध्ययन के रूप में शरीर के तरल पदार्थ में पाए जाते हैं वे गिरावट को लचीला कर रहे हैं और अलग पर्यावरणीय परिस्थितियों 3 की एक सीमा से अधिक स्थिर रहे हैं पता चला है. इन सुविधाओं, सीरम या परिसंचारी miRNAs आदर्श biomarker 4, 5 को देखते हुए. वर्तमान में जैविक तरल पदार्थ से छोटे आरएनए के अलगाव के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण हैं. दूसरा दृष्टिकोण फिनोल और guanidinium thiocyanate अभिकर्मकों 7 के साथ लंबे समय से चली आ रही प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, जबकि पहले दृष्टिकोण, छोटे RNAs 6 बाँध और elute करने के लिए स्तंभ आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है. हम मानव सीरम से छोटे RNAs अलग करने के लिए एक सरल, प्रभावी, स्तंभ मुक्त प्रोटोकॉल विकसित किया है. पृथक शाही सेना तुरंत हैडीएनए oligonucleotide सरणियों और शाही सेना अनुक्रमण सहित बहाव के अनुप्रयोगों में ately प्रयोग करने योग्य.
सीरम से शाही सेना को अलग करने के लिए फिनोल आधारित विधियों का उपयोग करते समय हम कई मुद्दों के साथ सामना कर रहे थे, क्योंकि यह प्रोटोकॉल विकसित किया गया था. पारंपरिक Chomczynski दृष्टिकोण अक्सर सबसे वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध अभिकर्मकों की एक सीमा के साथ सबसे प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है. हालांकि उनके व्यापक उपयोग पर विचार, कड़े दिशा निर्देशों लगातार विशेष रक्त या सीरम में, शारीरिक तरल पदार्थों से उच्च गुणवत्ता शाही सेना का उत्पादन करने के लिए विकसित नहीं किया गया है.
सीरम से शाही सेना को अलग करने के साथ जुड़े आम समस्याओं कम शाही सेना पैदावार और अलगाव, विशेष रूप से फिनोल के दौरान इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के साथ संदूषण शामिल हैं. हमारा दृष्टिकोण इस तरह के मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और शाही सेना अनुक्रमण के रूप में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए प्रदान करने के लिए इन फिनोल contaminants समाप्त. हम आगे miRNA सरणियों पर इस शाही सेना का परीक्षण किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
microRNAs की आबादी सीरम में पाया कुल शाही सेना के लगभग 0.4-0.5% का गठन किया. इसके अलावा मानव सीरम में पाया एक उच्च प्रोटीन सामग्री भी है. शाही सेना में सुधार और प्रोटीन और फिनोल दोनों को कम करने के लिए हम कई कदम के सा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सामन्था Khoury और पामेला Ajuyah ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार द्वारा समर्थित हैं. हम भी सामन्था Khoury के उनके अतिरिक्त सहायता के लिए translational कैंसर रिसर्च नेटवर्क, Lowy कैंसर रिसर्च सेंटर, न्यू साउथ वेल्स विश्वविद्यालय और उत्तरी translational कैंसर रिसर्च यूनिट को स्वीकार करना होगा.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Centre, USA | TR 118 | – |
| RNase free H20 | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | – |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | – |
| Heavy Phaselock Tube | 5PRIME | 2302830 | 2ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5mg/ml |
| RNA grade Isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated Centrifuge | John Morris | – | – |
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | – | – |
| RNA grade Ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyser | Agilent, USA | – | – |
Riferimenti
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