ヒト血清から小非コードRNAの分離

Summary

このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。

Abstract

RNAおよびその発現の分析は多くの研究室では一般的な機能です。重要なのは、哺乳動物細胞で発見されたマイクロRNAのような低分子RNAの登場です。これらの小さなRNAは、強力な遺伝子調節因子は、成長、開発、死などの重要な経路を制御し、大きな関心される体液中のそれらの発現に向けられてきた。これは、がんや血清バイオマーカーとしての可能性アプリケーションとしてのヒトの疾患での調節不全が原因です。しかしながら、血清中のmiRNA発現の分析は問題となり得る。ほとんどの場合、血清の量が制限され、血清は、小さなRNAが唯一の0.4から0.5パーセント^1を構成する総RNAを少量含まれています。このように血清から品質のRNAの十分な量の単離は、今日の研究者にとって大きな課題となっています。この技術的な研究では、DNAアレイまたはqPCR分析のどちらかのために十分なRNAを得るために、ヒト血清のわずか400μLを使用する方法を示しています。 Aこの方法のdvantagesは、その単純さと高品質のRNAを得る能力である。それは、小さなRNAの精製のための特殊な列を必要とせず、一般的な研究室で見つかった一般的な試薬およびハードウェアを利用しています。我々の方法は、同時に、高品質のRNAを得ながら、フェノールの混入を排除するために、フェーズロックゲルを利用する。また、さらに、分離工程の間に、すべての汚染物質を除去するために追加のステップをご紹介します。このプロトコルは、血清から最大100 ngの/μlの総RNAの収量を単離するのに非常に有効であるだけでなく、他の生体組織に適合させることができる。

Introduction

近年、ヒト疾患の早期発見のための新規なバイオマーカーを発見するためのプッシュ成長があった。注目は、潜在的なマーカーのようなマイクロRNA ^2（miRNAまたはのmiR）などの小さなRNAを使用して注目されている。これらの小さなRNAは、血清や研究などの体液で発見され、彼らが劣化し弾力性であり、様々な環境条件³の範囲に渡って安定しているが示されている。これらの機能は、血清中のmiRNAもしくは循環所与の理想的なバイオマーカー^4,5である。現在、生物学的液体から小さなRNAの単離には主に2つのアプローチがあります。第二のアプローチは、フェノールとグアニジンチオシアネート試薬⁷との長年のプロトコルを使用しながら、最初のアプローチは、小さなRNA ⁶と結合^し 、溶出するために、列ベースの技術を使用しています。我々は、ヒト血清からの低分子RNAを単離するための、シンプルで効果的な、列のないプロトコルを開発した。単離されたRNAは、直ちにですDNAオリゴヌクレオチド配列とRNAの塩基配列決定を含む下流の用途でately使用可能。

血清からRNAを単離するために、フェノールベースの​​方法を使用するときに我々はいくつかの問題に直面していたため、このプロトコルが開発されました。伝統をChomczynskiアプローチは頻繁にほとんどの商用ベンダーから入手可能な試薬の範囲で最も研究室で使用されています。しかしながら、それらの普及を考慮し、ストリンジェントなガイドラインは、一貫して、特定の血液または血清中に、体液からの高品質のRNAを産生するために開発されていない。

血清からRNAを単離に関連する一般的な問題は、低RNAの収量と分離、特にフェノールの際に使用する試薬の混入が含まれています。我々のアプローチは、例えば、定量的PCR（qPCR）およびRNA配列決定などの下流の分析のための高品質のRNAを提供するために、これらのフェノールの汚染物質を除去する。我々はさらに、miRNAアレイ上で、このRNAをテストしている。

Protocol

注意：健康な患者や癌患者からのヒト血清サンプルを、ロイヤルプリンスアルフレッド病院シドニー（プロトコル番号X10-0016およびHREC/10/RPAH/24）技術大学から認可された人間の倫理的なプロトコルの下でインフォームドコンセントが得られたシドニー。血清試料は、種々のシドニーの病院から手術前に患者から採取し、-80℃で貯蔵中に入れた血清から1。スモールRNAの単離</…

Representative Results

図1は、血清から単離されたRNAの典型的なUV /可視スペクトルを示している。このプロファイルから、我々はそれぞれ、両方の270 nmおよび230 nmにおけるフェノール及び有機汚染物質との280 nmでタンパク質の混入を指摘した。残留グアニジンチオシアネートも260 nmで注目された。汚染物質を減らすために、最適化の一連の工程は、標準的なトライ試薬RT-LSプロシージャに作製した。我…

Discussion

マイクロRNAの集団は、血清中に見出される総RNAの約0.4から0.5パーセントを構成する。さらに、ヒト血清中に見出される高タンパク質含量もある。 RNAを改善し、タンパク質とフェノールの両方を低減するために、我々はいくつかのステップを追加して、伝統的なアプローチをChomczynski ^9を変更した汚染する。

全RNAを、標準的なトライ試薬RT-LS（モレキュラー·リサー…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description (optional)
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Centre, USA	TR 118	–
RNase free H20	GIBCO Invitrogen	10977-023	–
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491	–
Heavy Phaselock Tube	5PRIME	2302830	2ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5mg/ml
RNA grade Isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated Centrifuge	John Morris	–	–
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA	–	–
RNA grade Ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyser	Agilent, USA	–	–