Isolering av Small kodende RNA fra Menneskelig Serum

Summary

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for ekstraksjon av små RNA fra humant serum. Vi har brukt denne metoden for å isolere microRNAs fra kreft serum til bruk i DNA-arrays og også singleplex kvantitativ PCR. Protokollen benytter fenol og guanidiniumtiocyanat reagenser med modifikasjoner å vike høy kvalitet RNA.

Abstract

Analyse av RNA og dets ekspresjon er et vanlig trekk i mange laboratorier. Av betydning er fremveksten av små RNA som microRNAs, som finnes i pattedyrceller. Disse små RNA er potente genet regulatorer styrer vitale trasé som vekst, utvikling og død, og mye interesse har vært rettet mot deres uttrykk i kroppsvæsker. Dette er på grunn av deres feilregulering i humane sykdommer så som kreft, og deres potensielle anvendelse som serum biomarkører. Imidlertid kan analysen av miRNA ekspresjon i serum være problematisk. I de fleste tilfeller er mengden av serum er begrensende og serum inneholder lave mengder av total RNA, hvorav små RNA utgjør bare 0,4 til 0,5% ^1. Således isolering av tilstrekkelige mengder av kvalitet RNA fra serum er en stor utfordring for forskere i dag. I dette teknisk papir, vi demonstrere en metode som bruker bare 400 mL av humant serum for å innhente tilstrekkelig RNA for enten DNA-matriser eller qPCR analyser. Den endvantages ved denne metoden er dens enkelhet og evne til å gi høy kvalitet RNA. Det krever ingen spesielle kolonner for rensing av små RNA og benytter generelle reagenser og maskinvare som finnes i vanlige laboratorier. Vår metode anvender en faselåst gel for å fjerne fenol forurensning mens den på samme tid gir høy kvalitet RNA. Vi introduserer også et ekstra trinn for ytterligere å fjerne alle forurensninger under isolasjonstrinnet. Denne protokollen er svært effektiv i å isolere utbytter av totale RNA på opptil 100 ng / mL av serum, men kan også tilpasses for andre biologiske vev.

Introduction

I de senere årene har det vært en økende trykk for å oppdage nye biomarkører for tidlig deteksjon av menneskelige sykdommer. Mye oppmerksomhet har vært fokusert på å bruke små RNA som microRNAs ² (mirnas eller Mirs) som potensielle markører. Disse små RNA er funnet i kroppsvæsker som serum, og studier har vist at de er motstandsdyktige mot nedbrytning, og er stabile over et område av varierende miljøforhold ^3. Gitt disse funksjonene, serum eller sirkulerende mirnas er den ideelle biomarkør ^{fire, fem.} Foreløpig er det to hovedtilnærminger for isolering av små RNA fra biologiske væsker. Den første metode anvender en kolonne basert teknologi for å binde og eluere de små RNA ^6, mens den andre fremgangsmåten anvender den langvarige protokoll med fenol-og guanidinium thiocyanate reagenser ^7. Vi har utviklet en enkel, effektiv, kolonne frie protokollen til å isolere små RNA fra humant serum. Den isolerte RNA er umiddelbart brukbare i nedstrøms applikasjoner, inkludert DNA oligonukleotid arrays og RNA sekvensering.

Denne protokollen ble utviklet fordi vi ble konfrontert med flere problemer ved bruk av fenol-baserte metoder for å isolere RNA fra serum. Den tradisjonelle Chomczynski tilnærmingen er hyppig brukt i de fleste laboratorier med et utvalg av reagenser tilgjengelige fra de fleste kommersielle leverandørene. Men vurderer sin utbredt bruk, strenge retningslinjer har ikke blitt utviklet for å produsere konsekvent høy kvalitet RNA fra kroppsvæsker, spesielt blod eller serum.

Vanlige problemer forbundet med å isolere RNA fra serum inkluderer lav RNA avkastning og forurensning med reagenser brukt under isolasjon, spesielt fenol. Vår tilnærming eliminerer disse fenol forurensninger for å gi høy kvalitet RNA for nedstrøms analyse som kvantitativ PCR (qPCR) og RNA sekvensering. Vi har videre testet dette RNA på miRNA arrays.

Protocol

Merk: Human serumprøver fra friske pasienter eller pasienter med kreft ble oppnådd med informert samtykke under godkjente menneskelige etiske protokoller fra Royal Prince Alfred Hospital Sydney (Protokoll nummer X10-0016 og HREC/10/RPAH/24) og University of Technology, Sydney. Serumprøver ble samlet fra pasienter før kirurgi fra forskjellige Sydney sykehus og plassert i lagring ved -80 ° C. 1.. Small RNA Isolation from Serum Total RNA ble fremstilt fra humant …

Representative Results

Fig. 1 representerer en typisk UV / Vis spekteret av RNA isolert fra serum. Fra denne profilen vi bemerket protein forurensning på 280 nm med fenol og organiske miljøgifter både på 270 nm og 230 nm, henholdsvis. Rester guanidiniumtiocyanat ble også bemerket ved 260 nm. For å redusere forurensninger, ble en serie av optimaliseringsfremgangsmåten vises til standard Tri-Reagent RT-LS prosedyre. Vi tilsatt 5 mg / ml glykogen å øke både den totale RNA-utbyttet og redusere forurensning (sort linje, …

Discussion

Populasjonen av microRNAs utgjør omtrent 0,4 til 0,5% av det totale RNA som finnes i serum. Videre er det også et høyt proteininnhold som finnes i humant serum. For å forbedre RNA og redusere både protein-og fenol forurenser vi har modifisert den tradisjonelle Chomczynski tilnærmingen ⁹ med tillegg av flere trinn.

Total RNA ble isolert fra serum ved hjelp av standard Tri-Reagent RT-LS (Molecular Research Centre) men når utført i vårt laboratorium, denne metoden ga RNA i s…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description (optional)
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Centre, USA	TR 118	–
RNase free H20	GIBCO Invitrogen	10977-023	–
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491	–
Heavy Phaselock Tube	5PRIME	2302830	2ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5mg/ml
RNA grade Isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated Centrifuge	John Morris	–	–
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA	–	–
RNA grade Ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyser	Agilent, USA	–	–