Этот протокол описан способ извлечения малые РНК из сыворотки крови человека. Мы использовали этот метод, чтобы изолировать микроРНК от рака сыворотки для использования в массивах ДНК, а также однокомпонентных количественной ПЦР. Протокол использует фенола и гуанидиния тиоцианат реагенты с изменениями, и получают высокое качество РНК.
Анализ РНК и ее выражения является общей чертой во многих лабораториях. Важное значение имеет появление малых РНК, как микроРНК, которые находятся в клетках млекопитающих. Эти малые РНК являются мощными регуляторами ген, контролирующий жизненные пути, такие как рост, развитие и смерть и большим интересом была направлена на их выражения в жидкостях организма. Это связано с их регуляции в человеческих заболеваний, таких как рак и их потенциального применения в качестве сыворотки биомаркеров. Тем не менее, анализ микроРНК выражения в сыворотке может быть проблематичным. В большинстве случаев количество сыворотки ограничения и сыворотка содержит небольшое количество общей РНК, из которых малые РНК составляют лишь 0,4-0,5% 1. Таким образом, изоляция достаточного количества качественного РНК из сыворотки является основной проблемой для исследователей сегодня. В этом техническом документе, мы демонстрируем метод, который использует только 400 мкл сыворотки крови человека, чтобы получить достаточную РНК или для массивов ДНК или анализа КПЦР.dvantages этого метода являются его простота и способность приносить высокое качество РНК. Она не требует специализированных колонки для очистки малых РНК и использует общие реагенты и оборудование, найденные в общих лабораториях. Наша методика использует блокировки гель фазу для устранения загрязнения фенола в то же время получают высокое качество РНК. Мы также ввести дополнительный шаг для дальнейшего удаления все загрязнения во время стадии выделения. Этот протокол является очень эффективным при выделении выходы общей РНК до 100 нг / мкл из сыворотки, но также могут быть адаптированы для других биологических тканей.
В последние годы наблюдается растущий нажим для того чтобы обнаружить новые биомаркеры для раннего выявления заболеваний человека. Большое внимание было сосредоточено на использовании малых РНК, такие как микроРНК 2 (микроРНК или Мирс) в качестве потенциальных маркеров. Эти малые РНК находятся в жидкостях организма, таких как сыворотка и исследования показали, что они устойчивы к деградации и стабильны в широком диапазоне различных условий окружающей среды 3. Учитывая эти особенности, сыворотки или циркулирующие микроРНК являются идеальным биомаркеров 4, 5. В настоящее время существует два основных подхода к выделению малых РНК из биологических жидкостей. Первый подход использует технологию столбца на основе связывать и вымывания малые РНК 6, в то время как второй подход использует давние протокол с фенолом и гуанидиния тиоцианатных реагентов 7. Мы разработали простой и эффективный, колонка без протокола, чтобы изолировать малые РНК из сыворотки крови человека. Выделенный РНК немедленноленно использовать в последующих применений, в том числе олигонуклеотидных ДНК массивов и РНК последовательности.
Этот протокол был разработан, потому что мы столкнулись с несколькими вопросами при использовании на основе фенола методы, чтобы изолировать РНК из сыворотки. Традиционный подход Chomczynski часто используется в большинстве лабораторий с диапазоном реагентов, доступных на большинстве коммерческих поставщиков. Однако, учитывая их широкое применение, строгие правила не были разработаны, чтобы постоянно производить высококачественный РНК из жидкостей организма, в частности, крови или сыворотке.
Общие проблемы, связанные с выделения РНК из сыворотки включают низкие урожаи РНК и загрязнения с реагентов, используемых в процессе выделения, в частности фенола. Наш подход устраняет эти фенольные загрязнений обеспечить высокое качество РНК для последующей анализа, таких как количественной ПЦР (КПЦР) и РНК последовательности. Далее мы тестировалась РНК на массивах микроРНК.
Популяция микроРНК составляет примерно 0,4-0,5% от общей РНК, найденного в сыворотке крови. Кроме того есть также высокое содержание белка, обнаруженного в сыворотке крови человека. Для улучшения РНК и снизить как белок и фенола загрязняет мы изменили традиционный подход Chomczynski 9 с д?…
The authors have nothing to disclose.
Саманта Хури и Памела Ajuyah поддерживаются Австралийской последипломного премии. Мы также хотели бы выразить признательность за трансляционных исследований рака Сеть, Лоуи исследования рака центр, Университет Нового Южного Уэльса и исследования рака Unit Северная Поступательное для их дополнительной поддержки Саманта Хури.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Centre, USA | TR 118 | – |
RNase free H20 | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | – |
Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | – |
Heavy Phaselock Tube | 5PRIME | 2302830 | 2ml capacity |
DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5ml capacity |
Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5mg/ml |
RNA grade Isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
Refrigerated Centrifuge | John Morris | – | – |
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | – | – |
RNA grade Ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
Agilent 2100 Bioanalyser | Agilent, USA | – | – |