Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar izolasyonu

Summary

Bu protokol, insan serumundan küçük RNA'ların ekstre edilmesi için bir yöntem tarif eder. Biz DNA dizileri kullanmak için kanser serumdan microRNA izole ve aynı zamanda singleplex kantitatif PCR için bu yöntemi kullandık. Protokol yüksek kalitede RNA elde edildi modifikasyonlarla fenol ve guanidinyum tiosiyanat reaktifler kullanır.

Abstract

RNA ve ifade analizi, çok laboratuvarda ortak bir özelliktir. Önemi memeli hücrelerinde bulunan mikroRNA'lar, gibi küçük RNA'lar çıkmasıdır. Bu küçük RNA'lar gibi büyüme, gelişme ve ölüm ve çok ilgi gibi hayati yollar kontrol güçlü gen düzenleyiciler vücut sıvılarında kendi ifadesi yönelik olmuştur vardır. Bu, kanser ve serum biyolojik olarak potansiyel uygulama gibi insan hastalıklarında da bozukluğunun kaynaklanmaktadır. Ancak, serum miRNA ifade analizi, sorunlu olabilir. Çoğu durumda, serum miktarı sınırlayıcı ve serum küçük RNA'lar tek 0,4-0,5% ¹ teşkil eden toplam RNA düşük miktarda içerir. Böylece serumdan kaliteli RNA yeterli miktarda izolasyon araştırmacılar için büyük bir meydan okuma bugün. Bu teknik yazıda, DNA dizileri veya qPCR analizi ya için yeterli RNA elde etmek insan serumu sadece 400 ul kullanan bir yöntem ortaya koymaktadır. BirBu yöntemin dvantages sadeliği ve kaliteli RNA verim yeteneği vardır. Bu küçük RNA'lar saflaştırılması için hiçbir özel sütunları gerektirir ve ortak laboratuvarlarda bulunan genel reaktifler ve donanım kullanır. Önerilen yöntem, aynı zamanda, yüksek kaliteli RNA netice verirken, fenol kirlenmeyi elimine etmek için, bir faz kilit Jel kullanır. Ayrıca, daha da izolasyon aşaması esnasında tüm kirleri çıkarmak için ek bir adım tanıtmak. Bu protokol, serumdan kadar 100 ng / ul toplam RNA izole verim çok etkili değil, aynı zamanda diğer biyolojik dokular için uyarlanabilir.

Introduction

Son yıllarda, insan hastalıklarının erken teşhisi için yeni biyomarkerler keşfetmek için büyüyen bir itme olmuştur. Çok dikkat potansiyel belirteçleri gibi microRNA ² (miRNAs veya Mirs) gibi küçük RNA'lar kullanılarak odaklanmıştır. Bu küçük RNA'lar gibi serum ve çalışmaları gibi vücut sıvılarında bulunan bu bozunmaya esnek ve değişen çevre koşulları ^3'ün bir aralığı üzerinde kararlı olduğunu göstermiştir. Bu özellikler, serum veya dolaşımdaki miRNA'ların İdeal biyobelirtecin ^{4, 5} göz önüne alındığında. Şu anda biyolojik sıvılardan küçük RNA izolasyonu için iki temel yaklaşım vardır. İkinci yaklaşım fenol ve guadinyum tiosianat reaktifler ⁷ ile uzun soluklu protokolü kullanan ise ilk yaklaşım, küçük RNA'lar ⁶ bağlamak ve eluteye sütun tabanlı teknoloji kullanır. Biz insan serumu küçük RNA'lar izole etmek için basit, etkili, kolonsuz protokol geliştirdik. İzole edilen RNA derhal olduğuDNA oligonükleotid diziler ve RNA sıralanması gibi aşağı uygulamalarda rilmesi kullanılabilir.

Serumdan RNA izole etmek için fenol-tabanlı yöntemler kullanarak zaman biz çeşitli konularda karşı karşıya, çünkü bu protokol geliştirildi. Geleneksel Chomczynski yaklaşım, sıklıkla bir çok ticari satıcılardan temin edilebilir tepkin bir dizi ile en laboratuarlarda kullanılmaktadır. Bununla birlikte yaygın kullanımları göz önüne alındığında, sıkı kurallar sürekli olarak belirli bir kan ya da serum içinde, vücut sıvıları yüksek kaliteli RNA'yı üretmek için geliştirilmiş edilmemiştir.

Serum RNA izole edilmesi ile bağlantılı ortak sorunlar düşük verimler ve RNA izolasyonu, özellikle fenol sırasında kullanılan reaktifleri ile kontaminasyonu içerir. Bizim yaklaşım, kantitatif PCR (qPCR) ve RNA sıralanması gibi alt analizi için yüksek kaliteli RNA sağlamak için bu fenol kirleticileri ortadan kaldırır. Biz daha miRNA dizileri bu RNA test ettik.

Protocol

Not: Sağlıklı hastalarda ya da kanser hastaları İnsan serum örnekleri, Kraliyet Prens Alfred Hastanesi Sydney (Protokol numarası X10-0016 ve HREC/10/RPAH/24) ve Teknoloji Üniversitesi onaylanan insan etik protokolleri altında rıza ile elde edildi Sydney. Serum örnekleri çeşitli Sydney hastane ameliyatı önceki hastalar toplanmış ve -80 ° C 'de depolama yerleştirildi Serum 1. Küçük RNA İzolasyon Toplam RNA, Tri-Reagent LS protokolü RT modi…

Representative Results

Şekil 1, serumdan izole edilmiş RNA tipik bir UV / Vis spektrumunu göstermektedir. Bu profil itibaren biz, sırasıyla her iki 270 nm ve 230 nm 'de fenol ve organik kirletici maddeler ile 280 nm'de protein kontaminasyonu kaydetti. Kalıntı, guanidinyum tiosiyanat da 260 nm'de tespit edilmiştir. Kirletici maddeleri azaltmak için, optimizasyon adımları bir dizi standart Tri-Reagent LS RT-prosedürü için yapılmıştır. Biz, total RNA verimi artırmak ve hem de bulaşma (siyah çizgi…

Discussion

MicroRNA nüfusu serumda bulunan toplam RNA'nın yaklaşık olarak% 0.4-0.5 oluşturmaktadır. Bundan başka, insan serumunda bulunan, yüksek protein içeriği de vardır. RNA ve protein geliştirmek ve fenol hem azaltmak için biz birkaç adımda eklenmesi ile geleneksel bir yaklaşım Chomczynski ⁹ olarak var kirlenmektedir.

Laboratuvarımızda gerçekleştirildiğinde Toplam RNA, standart Tri-Reagent LS RT-(Molecular Research Centre) kullanarak serumdan izole edilmiştir, …

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description (optional)
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Centre, USA	TR 118	–
RNase free H20	GIBCO Invitrogen	10977-023	–
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491	–
Heavy Phaselock Tube	5PRIME	2302830	2ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5mg/ml
RNA grade Isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated Centrifuge	John Morris	–	–
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA	–	–
RNA grade Ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyser	Agilent, USA	–	–