Detta protokoll beskriver ett förfarande för extraktion av små RNA från humant serum. Vi har använt denna metod för att isolera microRNAs från cancer serum för användning i DNA-matriser och även singleplex kvantitativ PCR. Protokollet använder fenol och guanidinium thiocyanate reagenser med ändringar ger hög kvalitet RNA.
Analys av RNA och dess uttryck är ett gemensamt drag i många laboratorier. Av betydelse är framväxten av små RNA som mikroRNA, som finns i däggdjursceller. Dessa små RNA är potenta genregulatorer kontrollerar viktiga vägar som tillväxt, utveckling och död och mycket intresse har riktats mot deras uttryck i kroppsvätskor. Detta beror på deras dysregulation i mänskliga sjukdomar som cancer och deras potentiella användning som serumbiomarkers. Emellertid kan analysen av miRNA uttryck i serum vara problematisk. I de flesta fall den mängd serum är begränsande och serum innehåller låga mängder av total-RNA, av vilka små RNA utgör endast 0,4 till 0,5% 1. Isolering av tillräckliga mängder av kvalitet RNA från serum är alltså en stor utmaning för forskare i dag. I denna tekniska papper, visar vi en metod som använder endast 400 l av humant serum för att erhålla tillräckligt RNA för antingen DNA-arrayer eller qPCR analys. I endvantages med denna metod är dess enkelhet och förmåga att ge högkvalitativt RNA. Det kräver inga speciella kolumner för rening av små RNA och använder allmänna reagenser och hårdvara som finns i vanliga laboratorier. Vår metod använder en faslåst Gel för att eliminera kontamine fenol medan på samma gång, vilket gav hög kvalitet RNA. Vi introducerar också ett ytterligare steg för att ytterligare ta bort alla föroreningar under isoleringssteget. Detta protokoll är mycket effektiv i att isolera utbytena av total-RNA på upp till 100 ng / ul från serum, men kan också anpassas för andra biologiska vävnader.
Under de senaste åren har det funnits ett växande tryck att upptäcka nya biomarkörer för tidig upptäckt av humana sjukdomar. Mycket uppmärksamhet har fokuserat på att använda små RNA såsom mikroRNA 2 (miRNA eller miRs) som potentiella markörer. Dessa små RNA återfinns i kroppsvätskor såsom serum och studier har visat att de är motståndskraftiga mot nedbrytning och är stabila över ett intervall av varierande miljövillkor 3. Med tanke på dessa funktioner, serum eller cirkulerande miRNA är den idealiska biomarkörer 4, 5. För närvarande finns det två huvudsakliga metoder för isolering av små RNA från biologiska vätskor. Den första metoden använder kolumnbaserad teknik för att binda och eluera små RNA 6, medan den andra metoden använder långvariga protokoll med fenol och guanidinium thiocyanate reagenser 7. Vi har utvecklat en enkel, effektiv, kolumn fritt protokoll för att isolera små RNA från humant serum. Det isolerade RNA är omedelbartbart kan användas i tillämpningar i senare led, bland annat DNA-oligonukleotid arrayer och RNA-sekvensering.
Detta protokoll har utvecklats för att vi konfronterades med flera problem vid användning av fenolbaserade metoder för att isolera RNA från serum. Den traditionella Chomczynski metod används ofta i de flesta laboratorier med en rad olika reagenser tillgängliga från de flesta kommersiella leverantörer. Men med tanke på deras omfattande användning, stränga riktlinjer har inte utvecklats för att konsekvent producera högkvalitativa RNA från kroppsvätskor, framför allt blod eller serum.
Vanliga problem i samband med att isolera RNA från serum inkluderar låga RNA avkastning och förorening med reagenser som används vid isolering, speciellt fenol. Vårt tillvägagångssätt eliminerar dessa fenolföroreningar för att ge hög kvalitet RNA för efterföljande analys såsom kvantitativ PCR (qPCR) och RNA-sekvensering. Vi har dessutom testat detta RNA på miRNA matriser.
Populationen av microRNAs utgör cirka 0,4-0,5% av den totala RNA som finns i serum. Vidare finns det också en hög proteinhalt som finns i humant serum. För att förbättra RNA och minska både protein och fenol förorenar vi har modifierat den traditionella Chomczynski tillvägagångssätt 9 med tillägg av flera steg.
Total RNA isolerades från serum med hjälp av standard Tri-reagens RT-LS (Molecular Research Centre) men när de utförs i vårt laboratorium, denna metod gav …
The authors have nothing to disclose.
Samantha Khoury och Pamela Ajuyah stöds av den australiska Graduate Award. Vi vill också tacka för det Translational Cancer Research Network, Lowy Cancer Research Centre, University of New South Wales och norra Translational Cancer Research Unit för deras ytterligare stöd av Samantha Khoury.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Centre, USA | TR 118 | – |
RNase free H20 | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | – |
Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | – |
Heavy Phaselock Tube | 5PRIME | 2302830 | 2ml capacity |
DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5ml capacity |
Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5mg/ml |
RNA grade Isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
Refrigerated Centrifuge | John Morris | – | – |
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | – | – |
RNA grade Ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
Agilent 2100 Bioanalyser | Agilent, USA | – | – |