Brug af gaskromatografi at analysere kompositoriske Ændringer af fedtsyrer i rottelevervæv under graviditet

Summary

Graviditet medfører væsentlige ændringer i fedtsyresammensætningen af ​​maternelle væv. Lipidprofiler kan hentes via gaskromatografi for at muliggøre identifikation og kvantificering af fedtsyrer i enkelte lipidklasser blandt rotter fodret forskellige high og fedtfattig kost under graviditeten.

Abstract

Gaschromatografi (GC) er en yderst følsom metode bruges til at identificere og kvantificere fedtsyreindholdet af lipider fra væv, celler og plasma / serum, hvilket giver resultater med høj præcision og høj reproducerbarhed. I metaboliske og ernæring undersøgelser GC tillader vurdering af ændringer i fede koncentrationer syre følgende tiltag eller under ændringer i fysiologiske tilstand, såsom graviditet. Fastfase-ekstraktion (SPE) ved anvendelse aminopropylsilicagel patroner tillader adskillelse af de store lipidklasser herunder triacylglyceroler, forskellige phospholipider og cholesterylestere (CE). GC kombineret med SPE blev brugt til at analysere ændringer i fedtsyresammensætningen af ​​CE-fraktionen i lever fra jomfruolie og gravide rotter, der var blevet fodret med forskellige høje og fedtfattig kost. Der er betydelige kost / graviditet interaktion virkninger på omega-3 og omega-6 fedtsyrer i leveren CE, hvilket indikerer, at gravide kvinder har en forskellig reaktion på kosten manipuleredeion end det ses blandt jomfruelige hunner.

Introduction

Gaschromatografi (GC) er en veletableret teknik, der anvendes til at identificere og kvantificere inkorporering af fedtsyrer i lipid pools og cellemembraner ^1,2 under tilskud eller fysiologiske tilstande såsom fedme (og relaterede sygdomme såsom diabetes) eller graviditet ^{3 – 5..} Det er også velegnet til at analysere de typer og mængder af fedt i fødevarer. Dette er nyttigt ved karakterisering forsøgsdiæter, samt sikre, at fødevareindustrien overholder lovgivningen. For eksempel kan GC anvendes til at bekræfte identiteten og mængden af fedtsyrer i et produkt som et kosttilskud for at sikre, at mærkningen er korrekt, og regler er overholdt til ^6,7. Analyse af fedtsyrer kan give værdifuld indsigt i lipid stofskiftet i sundhed og sygdom, virkningen af kostomlægning, og effekten af ændringer i fysiologiske tilstand ^8. Brug af GC for at studere prøver under graviditeten har givet vigtigoplysninger om ændringer i fedtsyre og kompleks lipid homeostase ^3.

Forud for den chromatografiske separation, er lipider typisk ekstraheret fra prøven ved hjælp af opløseligheden af ​​lipider i opløsningsmiddelblandinger af chloroform og methanol. Tilsættes natriumchlorid for at lette adskillelse af blandingen i vandig og organisk lipidholdige faser ^9,10. Komplekse lipidklasser af interesse kan adskilles fra den samlede fedtekstrakt ved fastfase-ekstraktion (SPE). Denne adskillelse teknik eluerer lipidklasser baseret på deres polaritet eller bindende affinitet. Triacyglycerols (TAG) og cholesterylestere (CE) elueres først som en kombineret fraktion yderligere klasser, phosphatidylcholin (PC), er phosphatidylethanolamin (PE), og ikke-esterificerede fedtsyrer (NEFA) blev elueret ved at øge polariteten af ​​elueringsopløsningsmidlet . Adskillelsen af ​​TAG fra CE udnytter binding af TAG kun til en frisk SPE patronDGE, så CE elueres. TAG kan derefter elueres ved at øge polariteten af eluering ^9,10 opløsningsmiddel. Denne fremgangsmåde giver mulighed for flere prøver, der skal adskilles samtidigt med et højere udbytte end opnås med tyndtlagskromatografi, hvilket betyder, at relativt små og mellemstore prøver (fx <100 ul plasma eller serum, <100 mg væv) kan analyseres ^11,12.

GC er en veletableret teknik først beskrevet i 1950'erne, og det blev foreslået, at den mobile fase i de dengang væske-væske-systemer kan erstattes med damp. Det blev oprindeligt anvendt til råolie analyse, men hurtigt udvides til andre områder, såsom aminosyreanalyse og lipid biokemi, som stadig er af stor interesse. Fremskridt i GC udstyr og teknologi såsom udvikling af kapillarkolonner fra de tidligere anvendte pakkede kolonner har ført til vores nuværende teknikker, hvor fedtsyrerne er i stand til at væreadskilt mere effektivt ved lavere temperaturer resulterer i GC rutinemæssigt anvendes til at identificere og kvantificere fedtsyrer i en lang række undersøgelser ^13.

GC kræver fedtsyrer, der skal derivatiseres, således at de kan blive tilstrækkelig flygtig til at blive elueret ved rimelige temperaturer uden termisk nedbrydning. Denne regel medfører substitution af en funktionel gruppe indeholdende hydrogen til at danne estere, thioestere eller amider til analyse. Methylestere almindeligt undersøgt derivater, som er fremstillet ved methylering. Ved denne metode esterbindinger i komplekse lipider hydrolyseres til at frigive frie fedtsyrer, som er transmethylated til dannelse af fedtsyremethylestere (FAME). Den resulterende profil FAME, bestemt ved GC, er nævnt som fedtsyresammensætningen og kan let sammenlignes mellem de forskellige eksperimentelle grupper ^9,10. Teknikken giver både proportionerne af individuelle fedtsyrer og deres koncentration skal måles.

Ud over anvendelse af GC til analyse af fedtsyrer i ernæring undersøgelser og inden for fødevareindustrien, Teknikken kan anvendes på en lang række af analytiske områder. For eksempel omfatter miljømæssige analyser ved GC måling vandforurening ved insekticider og jordbundsanalyser måling chlorbenzen indhold. I toksikologi, er GC også blevet brugt til at identificere illegale stoffer i urin og blodprøver fra enkeltpersoner sådan en sports produktionsfremmere ¹² og evnen til at adskille komplekse blandinger af kulbrinter gør denne teknik populær i olieindustrien til petrokemisk analyse ^12.

Graviditet er forbundet med væsentlige ændringer i fedtsyresammensætningen af ​​maternelle væv, specielt i indholdet af omega-3 (n-3) og omega-6 (n-6) polyumættede fedtsyrer Formidabeltds (PUFA) ^3. I den aktuelle undersøgelse, vi eksemplificere anvendelsen af ​​GC i målingen af ​​fedtsyrer ved at beskrive dens anvendelse i analyse af fedtsyresammensætningen i levervæv taget fra jomfruelige gravide rotter fodret lavt og højt fedtindhold med forskellige oliekilder. Forsøgskosten forudsat her var en fedtfattig sojaolie baseret kost, et højt fedtindhold sojaolie-baserede kost (130,9 g total fedt / kg total fedt) eller et højt fedtindhold linolie-baseret kost (130,9 g total fedt / kg kost), forudsat i 20 dage. Den fulde næringsstof og fedtsyresammensætning af disse diæter er blevet beskrevet tidligere ^14. Sojabønneolien kost er rig på linolsyre (18:02 n-6) og indeholder nogle α-linolensyre (18:03 n-3), mens linolie kost er rig på α-linolensyre. Disse højt fedtindhold kost repræsenterer forskellige rationer af linolsyre til α-linolensyre (rationer 8:1 og 1:1, henholdsvis). Fremgangsmåden til isolering af enkelte lipidklasser og ved GC er vill etableret og valideret, og er blevet offentliggjort tidligere ^10, men uden den detaljerede tekniske beskrivelse findes heri.

Protocol

1.. Dyreforsøg Alle dyr arbejde skal udføres i overensstemmelse med indenrigsministeriet Dyr (videnskabelige procedurer) Act (1986). Mate Wistarrotter alderen 10 uger gammel ved monogamt avl, og bekræft graviditet ved fremkomsten af ​​en vaginal prop. Optag dette som dag 1 i drægtighedsperioden, og begynde eksperimenterende kost. For jomfruelige hunner huse hver rotte individuelt, og begynde eksperimenterende kost. Efter fodring forsøgskosten i 20 dage aflive rotter ved CO 2<…

Representative Results

Succesen for denne metode er afhængig af at følge protokollen præcist og på ved hjælp af rene opløsningsmidler og reagenser for at reducere "støj" og forurening, der kan vises på et kromatogram. Forurenede prøver er mere udfordrende at analysere, sænke nøjagtigheden af ​​arealet under kurven beregninger. Hvis protokollen følges held et kromatogram med klare symmetriske, veldefinerede toppe og med minimal baggrundsstøj skal opnås som vist i figur 3. Hvis der er sket forurening…

Discussion

Gaskromatografi er en nøjagtig metode til at bruge til fedtsyre-analyse, og den høje reproducerbarhed finder denne teknik er egnet til kliniske analyser. Passende GC kolonner skal bruges til at muliggøre identifikation af fedtsyrer af interesse, med tilgængelige kolonner have variationer i polaritet den stationære fase, kolonne længde og indvendig diameter. Brugen af en smeltet silica kapillarkolonne i denne analysemetode giver god termisk stabilitet og høj reproducerbarhed af retentionstider grund af sin høje o…

Materials

Methanol:	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Chloroform:	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
BHT:	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns – 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns – 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas – explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge – Bead mass 100mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge – Bead mass 100mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6mm
Glass pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251
Borosilicate glass test tube	Fisher Scientific	FB59527	Non-screw cap
Screw thread glass test tubes	Fisher Scientific	FB59555	13mm
Caps for screw thread test tubes	Fisher Scientific	FB51353	To fit 13mm tube
Solida phase extraction (SPE) tank	Agilent		VacElut 20 Manifold
Luer stopcocks for SPE tank	Agilent	12131005
Vacuum pump	Sigma- Aldrich	2656-194GB-1EA
GC vials	Kinesis	STV 12-03TS	Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert
GC vial lids	Kinesis	SCC09-0.2B	Short thread 9mm blue
GC inlet liners	SGE Analytical science	092002	Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm
GC septa	SGE Analytical science	041856	11mm, MN material
GC column	SGE Analytical science	054612	Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm
Gas chromatograph			HP 6890 series