Het gebruik van gaschromatografie tot veranderingen in de samenstelling van vetzuren Analyseer in Rat leverweefsel tijdens de zwangerschap
Summary
Zwangerschap leidt tot belangrijke veranderingen in de vetzuursamenstelling van maternale weefsels. Lipidenprofiel kan worden verkregen via gaschromatografie van de identificatie en kwantificatie van vetzuren in individuele lipideklassen onder ratten verschillende hoge en lage vetgehalte diëten tijdens de zwangerschap.
Abstract
Gaschromatografie (GC) is een zeer gevoelige methode voor het vetzuurgehalte van lipiden identificeren en kwantificeren van weefsels, cellen en plasma / serum, waardoor resultaten met hoge nauwkeurigheid en hoge reproduceerbaarheid. Metabole en voeding studies laat GC beoordeling van veranderingen in vetzurenconcentraties volgende activiteiten of tijdens veranderingen in de fysiologische toestand, zoals zwangerschap. Vaste fase-extractie (SPE) met aminopropyl silica cartridge kan scheiding van grote lipide klassen waaronder triacylglycerolen, verschillende fosfolipiden en cholesteryl esters (CE). GC gecombineerd met SPE werd gebruikt om de veranderingen in vetzuursamenstelling van de CE-fractie in de levers van maagdelijke en zwangere ratten die waren gevoed verschillende hoge en lage vetgehalte diëten analyseren. Er zijn aanzienlijke dieet / zwangerschap interactie-effecten op de omega-3 en omega-6 vetzuren van lever CE, wat aangeeft dat zwangere vrouwen hebben een andere reactie op dieet manipulation dan wordt gezien bij maagdelijke vrouwtjes.
Introduction
Gaschromatografie (GC) is een gevestigde techniek voor de opname van vetzuren in aanvulling of fysiologische aandoeningen zoals obesitas (en verwante ziekten zoals diabetes) of zwangerschap 3 identificeren en kwantificeren in lipide zwembaden en celmembranen 1,2 – 5. Het is ook geschikt voor het analyseren van de soorten en hoeveelheden van vetten in voedingsmiddelen. Dit is handig wanneer het karakteriseren van experimentele diëten, alsmede ervoor te zorgen dat de voedingsindustrie voldoet aan regelgeving. Zo kunnen GC worden gebruikt om de identiteit en hoeveelheid van vetzuren in een product, zoals een voedingssupplement bevestigen zodat etikettering juist is en regels worden nageleefd 6,7. Analyse van vetzuren kan waardevolle inzichten in de vetstofwisseling in gezondheid en ziekte, de gevolgen van dieet te veranderen, en het effect van veranderingen in de fysiologische toestand 8 bieden. Gebruik van GC om monsters te bestuderen tijdens de zwangerschap is belangrijk verstrektinformatie over wijzigingen in vetzuur en complexe lipiden homeostase 3.
Voorafgaand aan de chromatografische scheiding, worden meestal lipiden geëxtraheerd uit het monster met de oplosbaarheid van lipiden in oplosmiddelmengsels van chloroform en methanol. Natriumchloride wordt toegevoegd om de scheiding van het mengsel in waterige en organische fasen lipide bevattende 9,10 vergemakkelijken. Complexe lipide klassen van belang kan uit het totale lipide extract gescheiden worden door vaste-fase-extractie (SPE). Deze scheidingstechniek spoelt lipide klassen op basis van hun polariteit of bindingsaffiniteit. Triacyglycerols (TAG) en cholesteryl esters (CE) eerst geëlueerd als een gecombineerde fractie verder klassen, fosfatidylcholine (PC), Fosfatidylethanolamine (PE) en niet-veresterde vetzuren (NEFA) worden geëlueerd door het verhogen van de polariteit van de loopvloeistof . De scheiding van TAG van CE maakt gebruik van de binding van TAG alleen voor een frisse SPE cartridgdge, waardoor CE worden geëlueerd. TAG kan vervolgens worden geëlueerd door het verhogen van de polariteit van het eluerende oplosmiddel 9,10. Deze methode maakt meerdere monsters tegelijkertijd worden gescheiden met een hogere opbrengst dan wordt bereikt met dunnelaagchromatografie, waardoor relatief klein formaat monsters (bijv. <100 gl plasma of serum, <100 mg weefsel) kunnen worden geanalyseerd 11,12.
GC is een gevestigde techniek voor het eerst beschreven in 1950, werd gesuggereerd dat de mobiele fase in het toen vloeistof-vloeistof systemen kunnen worden vervangen door stoom. Het werd aanvankelijk gebruikt voor de olie-analyse, maar snel uitgebreid naar andere gebieden, zoals aminozuur analyse en lipide biochemie, die nog steeds van groot belang. Vooruitgang in GC apparatuur en technologie, zoals de ontwikkeling van capillaire kolommen uit de eerder gebruikte gepakte kolommen heeft geleid tot de huidige technieken die vetzuren kunnen wordenefficiënter afgescheiden bij lagere temperaturen resulteert in GC wordt routinematig gebruikt om vetzuren in diverse onderzoeken 13 identificeren en te kwantificeren.
GC vereist vetzuren worden gederivatiseerd zodat zij voldoende vluchtig worden geëlueerd bij redelijke temperaturen zonder thermische ontleding kan worden. Meestal gaat de substitutie van een functionele groep die waterstof esters, thio-esters of amiden voor analyse vormen. Methylesters worden vaak bestudeerd derivaten die worden geproduceerd door methylering. In deze werkwijze de esterbindingen in complexe lipiden worden gehydrolyseerd tot vrije vetzuren, die transmethylated om vetzuurmethylesters (FAME) vormen loslaten. Het resulterende profiel van FAME, bepaald met GC, wordt aangeduid als de vetzuursamenstelling en kunnen gemakkelijk worden vergeleken tussen verschillende experimentele groepen 9,10. De techniek kan zowel de verhoudingen van indiUAL vetzuren en hun concentraties te meten.
Naast het gebruik van GC te analyseren vetzuren in de voeding studies en in de voedingsmiddelenindustrie kan de techniek worden gebruikt in diverse analytische velden. Bijvoorbeeld, milieu-analyses met behulp van GC omvatten het meten van verontreiniging van het water door insecticiden en bodemanalyses meten chlorobenzeen inhoud. In toxiciteitsstudies, is GC ook gebruikt om illegale stoffen in urine en bloedmonsters van personen te identificeren, dergelijke sportprestaties versterkers 12 en het vermogen om complexe mengsels van koolwaterstoffen te scheiden maakt deze techniek populair in de aardolie-industrie voor petrochemische analyse 12.
Zwangerschap wordt geassocieerd met significante veranderingen in de vetzuursamenstelling van maternale weefsels, met name in het gehalte aan omega-3 (n-3) en omega-6 (n-6) poly-onverzadigde vetzuren acids (PUFA) 3. In de huidige studie, illustreren wij het gebruik van GC in de meting van vetzuren door het beschrijven van het gebruik bij de analyse van de vetzuursamenstelling van leverweefsel genomen van ruwe en zwangere ratten laag en vetrijke diëten met verschillende oliebronnen. De experimentele diëten die hier waren een vetarm sojaolie gebaseerd dieet, een vetrijke soja-olie gebaseerde dieet (130,9 g totaal vet / kg totaal vet) of een vetrijke lijnzaad olie gebaseerde dieet (130,9 g totaal vet / kg dieet), voorzag in 20 dagen. De volledige voedingsstoffen en vetzuursamenstelling van deze diëten zijn eerder 14 beschreven. De sojaolie diëten rijk aan linolzuur (18:02 n-6) en bevatten enkele α-linoleenzuur (18:03 n-3) als de lijnolie dieet rijk aan α-linoleenzuur. Deze vetrijke diëten vertegenwoordigen verschillende rantsoenen linolzuur tot α-linoleenzuur (rantsoenen 8:01 en 1:01, respectievelijk). Werkwijze voor het isoleren van individuele lipideklassen en analyse door GC well vastgesteld en gevalideerd, en is eerder 10, maar zonder de gedetailleerde technische beschrijving gevonden hierin gepubliceerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gaschromatografie is een nauwkeurige techniek te gebruiken voor vetzuuranalyse en de hoge reproduceerbaarheid acht deze techniek in klinische analyses. Geschikte GC kolommen worden gebruikt voor identificatie van vetzuren plaats mogelijk, met beschikbare kolommen met variaties in de polariteit van de stationaire fase, kolomlengte en binnendiameter. Het gebruik van een gesmolten silica capillaire kolom in deze analysemethode biedt goede thermische stabiliteit en een hoge reproduceerbaarheid van de retentietijden door zij…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de bijdrage van Meritxell Romeu-Nadal aan de studie rat erkennen.
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
Riferimenti
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
- Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
